• Colorectal cancer
• Disrupter-E7
• DNA Damage
• drug resistance
• TS

Colorectal cancer (CRC) represents a major cause of cancer deaths worldwide. Although significant progress has been made through molecular and immune therapeutic approaches, the prognosis of advanced stage disease is still dismal. 5-Fluorouracil (5-FU) has been an important anti-cancer drug to date. With an increase in the knowledge of its mechanism of action, various treatment modalities have been developed over the past few decades to increase its anti-cancer activity. But drug resistance has greatly affected the clinical use of 5-FU.
In CRC, higher levels of Thymidylate synthase (hTS), the 5-FU target, were found associated with tumor insensitivity to 5-FU-based therapy. The main drawbacks of these therapies are drug toxicity and resistance development.
To overcome treatment-induced resistance, novel therapeutic strategies are required. In response to this need, we propose a new paradigm in hTS inhibition consisting of small molecules, such as Disrupter-E7, that target the enzyme dimer interface and favor dissociation of the catalytically active dimer to the inactive monomers. By targeting hTS and favoring its proteasomal degradation, the Disrupter-E7 halts DNA synthesis, causes DNA damage, and triggers apoptosis, resulting in cancer cell growth inhibition in vitro and in vivo.
The hTS is an essential enzyme for the de novo synthesis of thymidylate (dTMP). By targeting hTS, the Disrupter-E7 causes nucleotide pool imbalance and induces DNA damage (ɣ-H2A.X) after 4 hr in HCT116 cells (5-FU-resistant cell lines).
To check whether the DNA damage observed results from replication stress triggered by nucleotide pool imbalance, we performed the immunofluorescence (IF), by using the tumor suppressor P53-binding protein 1 (53BP1), a key marker of unresolved replication stress. The IF showed the increase of large 53BP1 Nuclear Bodies (NBs) in HCT116 treated cells after 4 hr with respect to untreated cells.
Damaged DNA and unreplicated DNA may affect the cell cycle. To check if the Disrupter-E7 perturbs the cell cycle, the HCT116 cells, treated with Disrupter-E7 and 5-FU were analyzed by Flow Cytometry. The results showed a significant increase in the percentage of the G2/M phase of the cell cycle (>35 %) with respect to untreated cells (17%). It is well known that the G2/M block prevents cells from entering mitosis when DNA is damaged. The new compounds (Disrupter-E7), by targeting hTS and reducing its cellular levels, can be able to overcome drug resistance development.

Il cancro colorettale (CRC) rappresenta una delle principali cause di morte per cancro in tutto il mondo. Sebbene siano stati compiuti progressi significativi attraverso approcci terapeutici molecolari e immunitari, la prognosi della malattia in stadio avanzato è ancora infausta. Il 5-fluorouracile (5-FU) è stato fino ad oggi un importante farmaco antitumorale. Con un aumento della conoscenza del suo meccanismo d'azione, negli ultimi decenni sono state sviluppate varie modalità di trattamento per aumentare la sua attività antitumorale. La resistenza ai farmaci, però, ha fortemente influenzato l'uso clinico del 5-FU. Nel CRC, livelli più elevati di timidilato sintasi (hTS), il bersaglio del 5-FU, sono stati trovati associati all'insensibilità del tumore alla terapia a base di 5-FU. I principali svantaggi di queste terapie sono la tossicità dei farmaci e lo sviluppo di resistenza. Per superare la resistenza indotta dal trattamento, sono necessarie nuove strategie terapeutiche. In risposta a questa esigenza, proponiamo un nuovo paradigma nell'inibizione di hTS costituito da piccole molecole, come Disrupter-E7, che mirano all'interfaccia del dimero enzimatico e favoriscono la dissociazione del dimero cataliticamente attivo nei monomeri inattivi. Prendendo di mira hTS e favorendo la sua degradazione proteasomica, il Disrupter-E7 arresta la sintesi del DNA, provoca danni al DNA e innesca l'apoptosi, con conseguente inibizione della crescita delle cellule tumorali in vitro e in vivo. L'hTS è un enzima essenziale per la sintesi de novo del timidilato (dTMP). Prendendo di mira hTS, il Disrupter-E7 provoca uno squilibrio del pool di nucleotidi e induce danni al DNA (ɣ-H2A.X) dopo 4 ore nelle cellule HCT116 (linee cellulari resistenti al 5-FU). Per verificare se il danno al DNA osservato deriva dallo stress di replicazione innescato dallo squilibrio del pool di nucleotidi, abbiamo eseguito l'immunofluorescenza (IF), utilizzando la proteina 1 legante il soppressore tumorale P53 (53BP1), un marker chiave dello stress di replicazione irrisolto. L'IF ha mostrato l'aumento di grandi corpi nucleari 53BP1 (NB) nelle cellule trattate con HCT116 dopo 4 ore rispetto alle cellule non trattate. Il DNA danneggiato e il DNA non replicato possono influenzare il ciclo cellulare. Per verificare se il Disrupter-E7 perturba il ciclo cellulare, le cellule HCT116, trattate con Disrupter-E7 e 5-FU sono state analizzate mediante citometria a flusso. I risultati hanno mostrato un aumento significativo della percentuale della fase G2/M del ciclo cellulare (>35%) rispetto alle cellule non trattate (17%). È ben noto che il blocco G2/M impedisce alle cellule di entrare nella mitosi quando il DNA è danneggiato. I nuovi composti (Disrupter-E7), prendendo di mira l'hTS e riducendone i livelli cellulari, possono essere in grado di superare lo sviluppo della resistenza ai farmaci.