Riassunto analitico
Il melanoma cutaneo, originato dalla proliferazione incontrollata dei melanociti, è il tumore cutaneo più comune e letale. È caratterizzato da un basso tasso di incidenza ma elevata mortalità, con un'età media alla diagnosi di 65 anni. Fino a 10 anni fa, il tasso di sopravvivenza globale a 5 anni dei pazienti con melanoma cutaneo metastatico era inferiore al 5%. Nell'ultimo decennio, questo scenario ha subito un cambiamento radicale, grazie all'avvento delle terapie target e delle immunoterapie. Tuttavia, considerando che la metà dei pazienti con melanoma avanzato ancora non beneficia di tali strategie, nuovi trattamenti dovrebbero essere sviluppati.
Considerando quanto sopra, l'obiettivo di questa tesi è quello di indagare il ruolo dell'approccio delle cellule anti-GD2 CAR-T come un nuovo potenziale trattamento per il melanoma cutaneo. In primo luogo, abbiamo ottimizzato un protocollo di dissociazione per isolare e stabilizzare le cellule tumorali da linfonodi metastatici resecati di pazienti con melanoma avanzato. Queste cellule tumorali primarie sono state caratterizzate per l'espressione del disialoganglioside GD2.
Parallelamente, abbiamo iniziato l'indagine di un possibile effetto citotossico delle cellule allogeniche anti-GD2 CAR-T contro la linea cellulare di melanoma SKMEL5 disponibile in commercio, sia nei modelli 2D che 3D. I risultati incoraggianti ottenuti nella regolazione allogenica hanno aperto la strada per gli esperimenti nella regolazione autologa.
Abbiamo selezionato il miglior candidato tra le cellule melanoma derivate dal paziente finora isolate, identificate come MEL BF54. Questo campione è stato ingegnerizzato per esprimere la proteina dsRED o l'enzima luciferasi. Per eseguire l'impostazione autologa, le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMCs) sono state isolate dal sangue del paziente e le cellule T si sono espanse in coltura. Queste cellule sono state trasdotte per esprimere la proteina fluorescente verde (GFP) da sola o anti-GD2 CAR con GFP. Esperimenti preliminari di co-cultura sono stati eseguiti in ambiente autologo. I risultati hanno mostrato un forte effetto letale dell'anti-GD2 CAR-T contro le cellule del melanoma, rafforzando i precedenti dati ottenuti dagli esperimenti allogenici.
Inoltre, abbiamo inoculato in maniera sottocutanea le cellule di melanoma primarie MEL BF54 in un topo NSG. Queste cellule si attaccarono e generarono un modello di topo xenotrapianto derivato dal paziente in vivo, stabilendo un modello importante per futuri esperimenti.
Collettivamente, i nostri risultati evidenziano che le cellule anti-GD2 CAR-T mediano una risposta antitumorale molto forte e specifica contro le cellule del melanoma, anche nell'ambizioso contesto autologo, suggerendo questo approccio come potenziale nuova opzione terapeutica per il melanoma cutaneo avanzato.
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Abstract
Cutaneous melanoma, originating from the uncontrolled proliferation of melanocytes, is the most common and lethal skin cancer. It is characterized by a low incidence rate but high mortality, with an average age at diagnosis of 65 years. Until 10 years ago, the 5-year overall survival rate of metastatic cutaneous melanoma patients was less than 5%. In the last decade, this scenario has undergone a dramatic change, thanks to the advent of target therapies and immunotherapies. However, considering that half of the advanced melanoma patients still does not benefit from those strategies, novel treatments should be developed.
Considering the above, the aim of this thesis is to investigate the role of the anti-GD2 CAR-T cell approach as a new potential treatment for cutaneous melanoma. Firstly, we optimized a dissociation protocol to isolate and stabilize cancer cells from resected metastatic lymph nodes of advanced melanoma patients. These primary tumour cells were characterized for disialoganglioside GD2 expression.
In parallel, we started the investigation of a possible cytotoxic effect of allogeneic anti-GD2 CAR-T cells again
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