Riassunto analitico
Le patologie ossee possono essere variamente causate da traumi, patologie o invecchiamento; a seguito di ciò si attivano processi di riparazione ossea che non sempre riescono a ripristinare la funzionalità dei segmenti scheletrici danneggiati. In tali casi (circa il 10%), qualora vi sia una perdita importante di tessuto osseo, è necessario ricorrere a varie strategie fra le quali i trapianti, che però non sono privi di criticità relative all’approvvigionamento di tessuto, alla morbilità del sito donatore, alla possibilità di trasmettere malattie/patogeni e alle potenziali reazioni immunitarie avverse. Tra gli approcci alternativi, volti a superare tali limiti, l’ingegneria tessutale propone l’utilizzo di scaffold innovativi e/o particolari stimoli fisico-chimici, con l’obiettivo ultimo di promuovere l’osteogenesi.
L’uso di scaffolds biocompatibili per indurre differenziamento e proliferazione dei precursori osteogenici e agevolare l’adesione cellulare allo scaffold, nel colmare i gap ossei, ha il target di migliorare la rigenerazione ossea. Tra i biomateriali di origine naturale, rivestono un ruolo importante gli ossicini sclerali (OS), piccole placchette ossee che si trovano presso il confine sclero-corneale del bulbo oculare di vertebrati inferiori (uccelli, rettili, anfibi, pesci). Raggiunta la taglia definitiva, gli OS (avendo come finalità quella di proteggere il bulbo oculare dalle deformazioni durante il nuoto o il volo) sono sottoposti ad stress stereotipati per tutta la vita dell’animale e per questo devono evitare modificazioni di massa e struttura, che si verificano mediante il rimodellamento osseo, scatenato dagli osteociti; per tale motivo gli osteociti vengono rimossi massivamente per apoptosi, e gli OS risultano pertanto naturalmente decellularizzati.
Tra le stimolazioni fisiche, invece, rivestono un ruolo importante i Campi Elettromagnetici Pulsati (CEMP) che, con opportune intensità e frequenze, sono in grado di attivare determinati pathway cellulari, indurre la proliferazione, diminuire il riassorbimento osseo e promuovere l’osteogenesi.
Lo scopo di questa tesi è quello di comprendere se e come gli ossicini sclerali e i CEMP, da soli o in combinazione tra loro, possano influenzare il differenziamento di osteoblasti umani (hOB) potenziandolo.
Le cellule sono state coltivate in vitro per 7 giorni in un terreno di coltura standard addizionato con acido ascorbico (AA) e β-glicerofosfato (β-gli) e sottoposti a stimoli differenziativi diversi: OS, CEMP, combinazione di CEMP+OS. Le osservazioni dell’avvenuto differenziamento sono state condotte dopo 2, 4 e 7 giorni di coltura utilizzando diverse metodiche: colorazione con rosso Alizarina S, che permette di visualizzare la presenza di depositi di Ca2+ nella Matrice Extracellulare; microscopia a fluorescenza che ha consentito di osservare l’espressione di osteocalcina, marker osteogenico che permette il monitoraggio del differenziamento; analisi proteica tramite western blot per la ricerca di variazioni nell’espressione di proteine del differenziamento degli hOB quali Matrix extracellular phosphoglycoprotein (MEPE), Dentin matrix acidic phosphoprotein-1 (Dmp-1), Alkaline Phosphatase (ALP) e Sclerostin.
I risultati hanno mostrato un effetto positivo sul differenziamento osteogenico, in presenza di medium addizionato con stimoli pro-differenzianti nelle diverse condizioni sperimentali: presenza di OS, applicazione di CEMP e loro combinazione (CEMP +OS). In particolare, si sono osservate differenze significative tra 2 e 7 giorni di differenziamento; ma i vari parametri testati hanno mostrato un andamento incostante nelle diverse condizioni sperimentali, per cui si devono approfondire alcuni aspetti per identificare le condizioni ottimali che promuovono l’osteogenesi.
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