Riassunto analitico
Gli enzimi fosfolipasi C fosfoninositide specifiche (PLC) idrolizzano il fosfatidilinositolo 4,5 bisfosfato (PIP2) per generare due secondi messaggeri: l’1,2-diacilglicerolo (DAG) e l’inositolo-1,4,5-tri-fosfato (IP3). Sono note tredici diverse PLC nei mammiferi, classificate in sei isotipi: β, γ, δ, ε, ζ, e η; la classificazione è principalmente dettata da caratteristiche strutturali. Alcune evidenze mostrano come gli enzimi PLC tendano a localizzarsi a livello di diversi compartimenti cellulari quali i prolungamenti citoplasmatici, l’ER e il Golgi e siano coinvolti in meccanismi di trafficking nucleo-citoplasma.
La molecola U73122 è un ammino-steroide di interesse clinico-traslazionale, largamente impiegato in studi preclinici per la sua capacità di inibire gli enzimi PLC. È stato ampiamente dimostrato come l’azione dell’inibitore sia caratterizzata da numerosi effetti off-target che coinvolgono numerose vie del segnale indipendenti dalle PLC (principalmente legati all’afflusso di ioni calcio e potassio dall’ambiente extracellulare, all’interazione con svariati recettori di membrana; importante è l’effetto estrogenico a causa dell’analogia strutturale di U73122 con il 17β-estradiolo). Il trattamento con U73122 di cellule stromali tumorali del tessuto osseo ha mostrato un effetto off target di alterazione dell’espressione genica di alcune PLC, si è osservata una down-regolazione di enzimi associati dalla letteratura alla progressione tumorale e una up-regolazione di PLC legate al differenziamento delle cellule ossee. È stato recentemente suggerito che ali enzimi PLC siano coinvolti nel differenziamento degli osteoblasti. L'effetto di alterazione dell’espressione genica di U73122 potrebbe potenzialmente modulare il differenziamento in vitro di osteoblasti umani. L’obiettivo di questa tesi è la caratterizzazione degli effetti di U73122 sull'espressione genica degli enzimi PLC in linee cellulari di osteoblasti umani (hOB), della presenza degli enzimi e la loro localizzazione intracellulare in diversi intervalli sperimentali, in cellule trattate con U73122 e cellule di controllo.
I dati della crescita cellulare sembrano confermare la bassa tossicità che U73122 ha sulle cellule trattate a concentrazione di 10µM. U73122 non ha determinato una netta downregolazione\ upregolazione nell’espressione dei trascritti dei geni PLC (i trascritti sono sempre espressi in tutte le popolazioni cellulari e in tutti gli intervalli sperimentali); tuttavia, si riscontrano piccole variazioni di intensità delle bande nei campioni trattati rispetto a quelli di controllo: in particolare un aumento al giorno 1 per PLCβ1 e un calo al giorno 2 per PLCγ2 e PLCη1.
Gli esperimenti di imaging hanno permesso di individuare tutte le isoforme PLC nelle hOB. Le PLC sono presenti a livello nucleare, citoplasmatico, in vescicole nel citoplasma (principalmente le isoforme β e δ) e in vescicole addossate alla membrana cellulare in regioni che sembrano costituire strutture simili a pseudopodi (principalmente le isoforme PLCβ2 e PLCβ3). Le differenze principali, per quanto riguarda la localizzazione spaziale degli enzimi PLC, sono state individuate principalmente per l’isoforma PLCβ1, che nel campione trattato viene trovata prevalentemente a livello nucleare (nei controlli vi è una distribuzione più omogenea nella cellula). Per il coinvolgimento in meccaniche di differenziamento, alterazioni a livello di espressione e di localizzazione spaziale di PLCβ1, risultano di particolare interesse biologico. Nell’esperimento di co-localizzazione degli enzimi all'ER, PLCε, PLCγ2 e PLCδ3 co-localizzano con calnexina in modo indipendente dal trattamento, questa evidenza necessita di un’indagine più approfondita per comprenderne meglio il significato.
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