Riassunto analitico
Nel campo delle biotecnologie alimentari, numerosi sono i prodotti che prevedono, in una o più fasi della loro filiera di produzione, l’utilizzo di comunità microbiche complesse. Il valore organolettico e nutrizionale dell’alimento e la buona riuscita del processo di lavorazione sono spesso dovuti alla composizione di tali comunità microbiche e al rapporto di abbondanze relative fra i taxa in esse esistenti. Risulta quindi essenziale caratterizzare queste comunità così da monitorarle in funzione dei parametri di produzione e predirne le proprietà metaboliche e funzionali. L’avvento di tecniche di sequenziamento high throughput (HTS) ha reso possibile l’analisi del microbiota tramite approcci coltura-indipendenti basati sul sequenziamento massivo di un gene marcatore, quale il gene 16S rRNA, da DNA ambientale (eDNA) estratto da matrici alimentari. Rispetto ai convenzionali metodi coltura-dipendenti, tali approcci, definiti di 16S rDNA metabarcoding, rilevano ed identificano anche specie microbiche minoritarie o specie difficilmente coltivabili.
Il presente studio si è proposto di definire, mediante analisi 16S rDNA metabarcoding, il profilo microbico di 10 campioni di siero innesto (natural whey starter, NWS) . I campioni di NWS, raccolti in 10 caseifici appartenenti all’area produzione del formaggio Parmigiano Reggiano DOP, sono stati caratterizzati tecnologicamente (pH, acidità titolabile e attività fermentativa ) e chimicamente (concentrazione di ac. lattico, etanolo, ac. citrico, ac. acetico e ac. succinico). Le analisi microbiologiche sono state condotte sia mediante approcci coltura-dipendenti sia mediante tecnica di DNA metabarcoding in piattaforma Illumina MiSeq paired-end di ampliconi delle regioni V3-V4 del gene 16S rRNA. Le conte vitali in piastra sono state condotte su terreno MRS per evidenziare la frazione coltivabile bacillare termofila, sia su terreno M17 modificato per evidenziare la frazione coccica termofila sia in condizioni di aerobiosi che di anaerobiosi. Contaminazioni di lieviti sono state evidenziate mediante conta su terreno YPDA a 27 °C (lieviti mesofili) e YPLA a 42°C (lieviti termofili lattosio fermentanti). Nell’ambito dell’approccio di 16S rDNA metabarcoding, la pipeline Qiime è stata utilizzata per assemblare, pulire e analizzare le reads ottenute. Si sono identificate 55 ASV, di queste quelle frequenti in misura inferiore alle 0.001% sono state eliminate restituendo 45 ASV finali. Utilizzando il database Silva, le ASV sono state ascritte a quattro specie, L. helveticus, L. delbrueckii, Streptococcus spp. e L. fermentum. L’analisi delle coordinate principali (PCoA) per gli indici di beta-diversity Bray-Curtis e weighted UniFrac ha permesso di clusterizzare i caseifici in due gruppi denominati H e D. L. helveticus e L. delbreuckii sono state dominanti in tutti i NWS, seguite da Streptoccoccus spp. e L. fermentum. Il 79.7% dell’abbondanza relativa media fra i campioni del cluster D appartiene alle specie L. delbrueckii and Streptoccoccus spp., mentre L. helveticus ha un valore di abbondanza relativa media fra i campioni del cluster H pari al 60.9%. L. fermentum è stato rilevato unicamente nel cluster H. L’analisi sPLS-DA in ha confermato come il taxon biomarker del cluster D è risultato Streptococcus spp. seguito da L. delbrueckii, mentre L. helveticus è biomarker del cluster H. La segregazione dei campioni in clusters D e H è stata parzialmente confermata mediante qPCR. L’analisi di correlazione di Spearman è stata infine condotta per stabilire potenziali relazione fra proprietà chimico-fisiche, conte in piastra e abbondanze relative. In conclusione, il presente studio ha permesso di identificare due tipologie di NWS, una dominate dall’associazione mutualistica L. delbrueckii e Streptococcus spp. e l’altra dominata dalla specie L. helveticus proteolitica e competente per la fermentazione del galattosio.
|
Abstract
In food biotechnology, many products entail the use of complex microbial communities in one or more phases of their production chain. The organoleptic and nutritional value of the resulting food and the success of the processing depend on the species composition in these microbial communities and on the relative abundances ratio between the taxa existing in them. Therefore, it is pivotal to profile these communities to monitor their changes in function of production parameters and to predict their metabolic and functional properties. The advent of high throughput sequencing (HTS) techniques has made possible to analyze the microbiota through culture-independent approaches based on the massive sequencing of a marker gene, such as the 16S rRNA gene, from environmental DNA (eDNA) extracted from food matrices. In comparison to the conventional culture-dependent methods, these approaches, termed 16S rDNA metabarcoding, can detect and identify sub-represented microbial species or species difficult to cultivate.
The present study aimed to define, through 16S rDNA metabarcoding analysis, the microbial profile of 10 samples of natural whey starter (NWS). The NWS samples, collected in 10 dairies distributed in the Parmigiano Reggiano PDO cheese production area, were subjected to technological (pH, titratable acidity and fermentation activity) and chemical characterization (concentrations of lactic acid, ethanol, citric acid, acetic acid, and succinic acid). Microbiological analyses were carried out both by culture-dependent approaches and DNA metabarcoding of the V3-V4 regions of the 16S rRNA gene obtained from the Illumina MiSeq paired-end platform. The viable plate counts were determined on MRS medium to detect the thermophilic rod-shaped cultivable fraction and on M17 medium to detect the thermophilic cocci under aerobiosis and anaerobiosis. Yeast contaminations were determined by plate counts on YPDA and YPLA at 27 °C (mesophilic yeasts) at 42°C (thermophilic fermenting lactose yeasts), respectively. As part of the 16S rDNA metabarcoding approach, the Qiime pipeline was used to assemble, trim, and analyze the obtained reads. We identified 55 ASVs, of which the ones with a frequency fewer than 0.001% were eliminated, resulting into 45 final ASVs. Using the Silva database, ASVs were ascribed to four species, L. helveticus, L. delbrueckii, Streptococcus spp. and L. fermentum, respectively. The principal coordinates analysis (PCoA) for the Bray-Curtis and weighted UniFrac beta-diversity indices allowed to cluster the NWS samples into two groups called H and D. Lactobacillus helveticus and L. delbreuckii were dominant in all NWS, followed by Streptoccoccus spp. and L. fermentum. L. delbrueckii and Streptoccoccus spp. covered the 79.7% of the average relative abundance in cluster D, while L. helveticus has an average relative abundance value of 60.9 % in cluster H. Limosilactobacillus fermentum was detected only in cluster H (mean relative abundance 0.24%). The sPLS-DA analysis confirmed that Streptococcus spp was the biomarker taxon of cluster D, followed by L. delbrueckii, while L. helveticus was biomarker for cluster H. The segregation of samples into clusters D and H was partially confirmed by qPCR analysis too. Finally, Spearman's correlation analysis was performed to establish possible links between chemical-physical properties, plate counts and relative abundances. In conclusion the present study recognized two types of NWS, those dominated by the mutualistic association between L. delbrueckii and Streptoccoccus and those dominated by the proteolytic and galactose fermentation competent species L. helveticus.
|
