Riassunto analitico
La biopsia liquida è una tecnica di analisi che presenta un potenziale enorme nella gestione dei pazienti oncologici rispetto alla comune biopsia tissutale e può portare ad un miglioramento nella predittività, nella prevenzione e nella personalizzazione della terapia. Si tratta di una tecnica che permette di analizzare una vasta gamma di biomarkers in numerosi liquidi biologici. Nel progetto di studio in questione, denominato BIOLIQUID2021, la biopsia liquida è stata applicata alla caratterizzazione di pazienti affetti da linfoma follicolare. Per una corretta e completa diagnosi di linfoma follicolare, oltre ad indagini di imaging, analisi del sangue complete, è necessaria la biopsia tissutale per stabilire il grading e completare il processo di stadiazione. L’innovazione costituita dallo studio BIOLIQUID2021 consiste nel fatto che si tratta di uno dei primi del suo genere, in quanto fino a questo momento i linfomi indolenti non sono ancora stati caratterizzati in maniera approfondita con questa metodica. Il motivo risiede in una concentrazione di DNA tumorale circolante inferiore rispetto ai linfomi aggressivi Alla base dello studio vi è l’esigenza di sviluppo di uno strumento diagnostico che a differenza della biopsia tissutale permetta di ottenere delle informazioni rappresentative di tutta la malattia e non soltanto del singolo linfonodo biopsiato e, inoltre, che sia facilmente eseguibile e poco invasiva. Ne consegue che la biopsia liquida si pone come un’ottima candidata dal momento che richiede un prelievo di sangue periferico del paziente, a partire dal quale viene isolato il DNA tumorale circolante (ctDNA), che sarà confrontato con la biopsia tissutale presente in biobanca (FFPE DNA) e con i linfociti di controllo (gDNA). Sui campioni viene effettuato uno studio di CAPP-seq che permette di ottenere una risoluzione maggiore rispetto al sequenziamento canonico. I campioni di gDNA sono utilizzati come confronto per identificare le informazioni genetiche del soggetto in esame e quindi non considerate nel campione di ctDNA e FFPE DNA. Il 50% della popolazione è entrata in studio con un grado 1-2 che è il più frequente per i FL, mentre circa un 40% era ancora in corso per una stadiazione o non vi era materiale sufficiente per stabilire il grading a causa della valutazione mediante agobiopsia. Per quanto riguarda lo stadio, il 50% aveva uno stadio IV che è comune nel caso di diagnosi di linfomi indolenti come il FL. Per quanto riguarda lo sviluppo del pannello, il sistema KAPA HyperCap si è dimostrato essere un metodo valido ed affidabile. Dopo una ricerca tramite articoli e banche dati, sono stati individuati 170 geni importanti per lo sviluppo dei FL e sono stati inseriti nel sistema HyperDesign, il quale ha restituito un primo risultato di possibili sonde specifiche per questi nostri target. In seguito ad una verifica tramite UCSC Genome Browser, è stato ottimizzato ulteriormente il risultato iniziale di HyperDesign ottenendo una copertura specifica dei nostri target del 98.88%. Per la messa a punto del protocollo di estrazione del ctDNA, il kit QIAGEN si è dimostrato avere una capacità di estrazione superiore rispetto ai due sistemi Maxwell permettendo di ottenere campioni con quasi il 50% in più di concentrazione a parità di volume. Questa differenza potrebbe derivare da una più elevata affinità della membrana del kit Qiagen per il ctDNA rispetto ai kit Maxwell. Per l’estrazione dei linfociti T necessari per l’ottenimento del gDNA, è stata impiegata una separazione tramite Ficoll e successivamente tramite FACS il quale ha portato all’ottenimento di un campione puro al 99%. Lo studio BIOLIQUID2021 proseguirà con l’analisi di CAPP-seq, prevedendo di indirizzare la ricerca verso la validazione della biopsia liquida come strumento di monitoraggio sia durante la terapia sia post-terapia.
|
Abstract
Liquid biopsy is a novel analytical tecnique with a high potential in the management of oncologic patients in comparison with the current tissue biopsy. It can lead to an improvement in the predictivity, in the prevention and in the personalization of the therapy.
In BIOLOQUID2021 study, liquid biopsy has been applied to the characterization of patients affected by follicular lymphoma. This study is based on the necessity to develop a new diagnostic tool capable of obtaining information which could be representative of the whole pathology, not just limited to the single biopsed lymphonode, as it happens for the tissue biopsy. Moreover, this new methodology is not invasive and easily to perform.
As a result, liquid biopsy sets itself as a promosing candidate. It relies on the sampling of peripheral blood from the patient, from which the circulating tumor DNA is isolated and subsequently compared with the tissue biopsy stored in biobank (FFPE DNA) and with the control lymphocytes (genomic DNA). The samples undergo a CAPP-seq study in order to obtain a higher resolution for the research of genetic lesion in comparison to the canonic sequencing.
gDNA samples serve as a comparison for identifying the genetic information of the subjects, which are not present in the ctDNA and FFPE DNA samples.
This research project aims at obtaining a mutational asset of the ctDNA similar to the FFPE DNA, with the addition of further mutations, so as to achieve a general representation of the pathology as a whole.
The population under examination shows a fair distribution between genders and a similar average age.
As far as the staging is concerned, 50% of the patients had stage IV, frequent in indolent lymphomas. thirty per cent of the subjects were classified as FLIPI 3, while 40% were FLIPI 2. sixty five percent of the patients had been treated with immunochemiotherapic protocols, with a 40% of complete responses and another 40% of responses yet to be classified.
Regarding the construction of the panel, the KAPA Hyper Cap system has demonstrated to be a reliable method. A research via literature and databases (COSIMC) led to identify 170 genes involved in the development of FLs, which were then inserted in the HyperDesign system. This analyses returned a preliminary result of potentially specific probes for the targets of interest. Following a validation using UCSC Genome Browser, this initial result was optimized, with a specific target coverage of 98.88%.
In order to optimize the protocol for the ctDNA extraction, QIAGEN kit proved to be the one with the higher extraction performance in comparison to Maxwell kits, reaching a 50% more ctDNA concentration for the same volume. This difference could be explained by a higher affinity of the Qiagen membrane for ctDNA compared to the Maxwell kits, whose mechanism relies on beads. Subsequently, the extraction of T lymphocytes for the gDNA was achieved thanks to a Ficoll separation and a FACS analysis, resulting in a sample 99% pure.
The BIOLIQUID2021 study will continue with the CAPP-seq analysis, with the aim to direct the research towards the validation of the liquid biopsy as a monitoring tool both during and after the therapy.
|