Riassunto analitico
La distrofia Facio Scapolo Omerale (FSHD) è la terza miopatia più comune con una prevalenza stimata di 1: 20000. È caratterizzata da atrofia progressiva dei muscoli facciali, delle spalle e tibiale anteriore. Mostra un'elevata variabilità nell'età di esordio e progressione. La diagnosi di FSHD è sempre stata clinica, dallo sviluppo delle tecnologie a DNA, l’obbiettivo per ogni gruppo di ricerca nei primi anni '90 è stato quello di identificare un gene candidato per FSHD. Analisi di linkage hanno associato la malattia ad una riduzione delle unità ripetute in tandem D4Z4 (DRA) nel locus 4q35. Descritta come una malattia autosomica dominante, anche se alcuni studi rivelano un modello più complesso di ereditarietà. Questo rende la FSHD una malattia genetica multifattoriale. A causa dell’alta omologia di sequenza tra D4Z4 su 4q35 e altre regioni nel genoma, (98% su 10q26) in questi loci possono verificarsi riarrangiamenti genomici, con il meccanismo di ricombinazione omologa non-allelica (NHAR). I riarrangiamenti cromosomici si verificano più spesso nelle regioni sub-telomeriche a causa delle loro sequenze ripetute. Il risultato della NHAR sono riarrangiamenti ricorrenti, importanti nello studio delle malattie complesse perché sono associate con l’insorgenza di mutazioni sporadiche (de novo). Le mutazioni de novo sono varianti non ereditate dai genitori. Il tasso di mutazioni de novo è considerato di grande importanza per l'evoluzione e la patologia. Per quanto riguarda la FSHD, gli alleli de novo si stima siano il 10-30% dei probandi. I portatori de novo sono un gruppo eterogeneo di pazienti, mostrano esordio infantile, a volte caratteristiche sindromiche e alleli D4Z4 più molto corti (1-3 unità D4Z4). La presenza di DRA in questi soggetti è associata ad un rischio dell'88,7% di sviluppare problemi motori. I dati clinici analizzati con la Comprehensive Clinical Evaluation Form (CCEF) permetteono l'associazione di una categoria e un FSHD score ad un fenotipo clinico. Questo studio valuta il sesso e l’età dei genitori, fattori che possono influenzare il tasso di mutazioni de novo o l’esordio di malattia. Il laboratorio Miogen detiene il Registro Nazionale Italiano per FSHD (INRF). Analizza il DNA dei pazienti e delle loro famiglie con tecniche di genetica molecolare e collabora con quattordici centri clinici in Italia per offrire un servizio di consulenza genetica e neurologica. Questo studio analizza le caratteristiche cliniche e molecolari nei pazienti FSHD portatori di mutazioni de novo sul D4Z4, e la coorte comprende i probandi de novo e i loro parenti. Abbiamo eseguito Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) con DNA cromosomico per stabilire profili allelici di 4q35. La digestione enzimatica EcoRI ed EcoRI/BlnI, crea un pattern di frammenti che permette di rilevare se c'è stato un riarrangiamento genomico (traslocazioni, duplicazioni, delezioni, mosaicismi). L'elettroforesi lineare (LGE) permette di determinare gli alleli più corti associate alla FSHD, altrimenti non attribuibili con PFGE. Anche se questa tecnica non consente di quantificare la percentuale di cellule coinvolte nel mosaicismo, la presenza può essere importante per valutare il fenotipo clinico e la trasmissione alla progenie. I dati molecolari sono serviti per valutare una possibile relazione con specifiche caratteristiche cliniche e con la gravità nella compromissione muscolare. Nelle malattie complesse, la selezione e la stratificazione dei pazienti sono importanti per comprendere i meccanismi patogenetici. In questo lavoro abbiamo cercato di migliorare le conoscenze su questa categoria di pazienti affetti da FSHD e di determinare se ci sono meccanismi molecolari comuni alla base dell'ampia variabilità clinica osservata tra i portatori di DRA.
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Abstract
Facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) is the third most common myopathy with an estimated prevalence of 1: 20000. FSHD is characterized by progressive atrophy of facial, shoulder and anterior leg muscles, displays a high interfamilial and intrafamilial variability in age at onset and progression. FSHD diagnosis has always been clinical, based on neurologist and geneticists’ evidence. Since DNA technologies arose, the clue for every research group in the early 90ies was to find a candidate gene for FSHD. Linkage analysis reported the segregation of the disease with a reduction of D4Z4 tandem repeats (DRA) in 4q35. Literature describes FSHD as an autosomal dominant disease, but findings reveal a more complex pattern of inheritance. This outcome, describe FSHD as a multifactorial genetic disorder. Due to the high sequence homology between D4Z4 on 4q35 and other regions through the genome, (98% on 10q26) many genomic rearrangements can occur at these loci, with the main mechanism of Non-Allelic Homologous Recombination (NHAR). Chromosomal rearrangements occur more frequently in the sub-telomeric regions because of their repetitive structure. The result of NHAR are recurrent rearrangements, which are important in the study of complex and developmental diseases because they are associated with onset of sporadic (de novo) mutations. De novo mutations are variants not inherited from parents. The rate of de novo mutations is considered of major importance to evolution and human disease. Regarding FSHD, de novo alleles are estimated as the 10-33% of probands. De novo carriers are a heterogenic group of patients, who can display infantile onset, syndromic features and shortest D4Z4 allele possible (1-3 D4Z4 units). DRAs laying in 1-3 units are associated with an 88.7% risk of developing motor impairment. Clinical data analyzed with Comprehensive Clinical Evaluation Form (CCEF) allows researchers to associate a category to classify clinical phenotype and a FSHD-score of motor impairment. We also focus on parental sex and age, which can influence de novo mutations rate and disease clinical manifestation. During the years of diagnostic laboratory practice, Miogen Laboratory owns the Italian National Registry for FSHD (INRF). It analyzes patients’ and their families DNA with molecular genetics techniques and collaborates with fourteen neurological centers in Italy to offer a service of genetic and neurological counseling. This study aims at investigating the clinical and molecular features in FSHD patients carrying de novo mutations of D4Z4 alleles. The cohort analyzes de novo probands and their relatives. We performed Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) with chromosomic DNA agarose plugs to establish allelic profiles of 4q35. EcoRI and EcoRI/BlnI enzymatic digestion, create a pattern of fragments that allows us to detect if a genomic rearrangement (translocations, duplications, deletion, mosaicisms) occurred and in which frequency. Linear Gel Electrophoresis (LGE) sizes shortest alleles associated with FSHD, otherwise not attributable with PFGE. Even if this technique does not allow to quantify the percentage of cells involved in mosaicism, assessing its presence can be considerable for clinical severity mitigation, or transmission to progeny. We collected molecular data to evaluate a possible relation with specific clinical features and motor impairment severity. In complex diseases, patients’ selection and stratification is important in order to understand molecular pathogenic mechanisms. We aimed to ameliorate knowledge about this category of patients affected by FSHD and to determine if there are common molecular mechanism underlying the wide clinical variability observed among DRA carriers.
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