Riassunto analitico
La distrofia facio scapolo omerale (FSHD) è la terza miopatia ereditaria per numero di soggetti affetti ed è stata associata a riarrangiamenti patologici della sequenza ripetuta in tandem chiamata D4Z4 nella regione subtelomerica del cromosoma 4. La contrazione del repeat è considerata mediare una alterazione della struttura cromatinica nel locus, risultante nella trascrizione anomala dei geni posti immediatamente a monte. Tra questi geni FRG2, è il gene più vicino alla regione ripetuta e mostra bassissimi livelli trascrizionali in cellule primarie derivanti da pazienti FSHD e controlli. Abbiamo precedentemente dimostrato come l’abbondanza del trascritto FRG2 aumenta nelle cellule sottoposte a trattamento con agenti modificanti la cromatina o agenti genotossici, e che l’intensità di questo fenomeno è legata in maniera inversamente proporzionale con la dimensione di D4Z4. Queste osservazioni suggeriscono che FRG2 sia represso in condizioni fisiologiche ma derepresso in pazienti FSHD sottoposti a danno al DNA. Inoltre, questa derepressione è mediata da cambiamenti epigenetici che avvengono nella regione promotoriale di FRG2. Queste indicazioni puntano a FRG2 come primo indicatore dello status epigenetico della regione e questo ci ha portato ad investigare la funzione del suo prodotto genico.
Ad oggi, il prodotto del gene FRG2 non è stato associato a una proteina, né previsto per avere una funzione. La proteina putativa non è mai stata osservata per la mancanza di un anticorpo specifico. Per superare questo problema abbiamo progettato una strategia sperimentale per aggiungere un tag molecolare al prodotto proteico FRG2. Sfruttando lo strumento di editing genico CRISPR/Cas9, la sequenza Flag-tag è stata fusa al CDS di FRG2 al fine di ottenere una proteina di fusione Flag-FRG2 facilmente rilevabile.
Per evitare i problemi possibili dovuti instabilità della proteina risultante, la strategia di modifica del genoma è stata disegnata per guidare l'inserzione di sequenza a 3' ed al 5' del gene. Inoltre,
per analizzare il comportamento di FRG2 in diversi background genomici, abbiamo eseguito la modifica del genoma nelle linee cellulari HEK 293T e Hela. Abbiamo selezionato la linea cellulare Hela perché entrambi gli alleli D4Z4 in 4q35 sono ridotti, ricapitolando la condizione genomica dei pazienti FSHD. Come confronto, HEK 293T porta una contrazione di un array ripetuto molto simile in 10q26 che non è in linkage con la malattia. Considerando l'esistenza dei geni paraloghi di FRG2 nel genoma, l'interrogazione del gRNA non è prevista bersagliare solo FRG2a sul cromosoma 4.
Per questo si è resa necessaria l’espansione clonale e la selezione dei cloni correttamente modificati in 4q35 attraverso una PCR ad alta stringenza. Le analisi di espressione hanno rivelato che i cloni ingegnerizzati erano in grado di produrre il trascritto di fusione Flag-FRG2 in risposta ai a farmaci dannosi per il DNA, in parallelo ai nostri risultati precedenti ottenuti con il gene endogeno. È interessante notare che, anche se è stato osservato il trascritto di fusione, nell'analisi western blot non siamo stati in grado di rilevare la proteina di fusione nelle stesse condizioni.
Questi risultati, insieme con ulteriore analisi delle caratteristiche del gene di FRG2, hanno rivelato globalmente che FRG2a non è un gene codificante ma un lncRNA, di cui la funzione deve ancora essere delucidata. Questi dati ridefiniscono globalmente il paradigma FRG2, portando a una migliore comprensione della sua funzione e del suo ruolo nella patogenesi FSHD.
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Abstract
Facioscapulohumeral muscolar dystrophy (FSHD) is the third most common hereditary myopathy, and it has been associated with rearrangements of tandemly repeated array named D4Z4, located at chromosome 4q35. Array contraction is thought to mediate an alteration of the chromatin structure in the locus, resulting in an aberrant transcription of the genes located immediately upstream. Among these genes, FRG2 is the most proximal gene to the repeat array, and shows barely detectable transcriptional levels in FSHD and control-derived primary cells. We have previously demonstrated that FRG2 transcript abundance increases in cells upon treatment with chromatin modifying agents or genotoxic drugs and the magnitude of this phenomenon inversely correlates with D4Z4 size. These observations suggest that FRG2 is repressed under physiological condition but derepressed in FSHD patients under DNA damaging noxa. Further, this derepression is mediated by epigenetic changes occurring at FGR2 promoter region. These findings point at FRG2 as a proxy indicator of 4q35 epigenetic activity and prompted us to investigate FRG2 gene product function.
To date, FRG2 gene product has neither been associated with a protein, nor predicted to have a function. Predicted protein has never been observed since the lack of a FRG2-specific antibody. To overcome this issue we designed an experimental strategy to add a molecular tag to FRG2 protein product. Taking advantage of CRISPR/Cas9 gene editing tool the Flag-tag sequence was fused at FRG2 CDS in order to obtain an easy detectable Flag-FRG2 fusion protein.
To avoid possible problems due to protein instability, the genome modification strategy was designed to drive sequence insertion at 3’ and at the 5’ of the predicted FRG2 CDS. Furthermore,
to analyse FRG2 behaviour in different cell backgrounds, we to performed genome modification on both HEK 293T and HeLa cell lines. We selected HeLa cell line because both D4Z4 allele in 4q35 are reduced, recapitulating genomic condition of FSHD patients. As comparison, HEK 293T carries a contraction of a highly similar repeated array in 10q26 which is not in linkage with FSHD. Considering the existence of FRG2 paralogs in the genome, gRNA integration is not predicted to target FRG2a on chromosome 4 alone. Thus, clonal expansion was performed and clones carrying the intended modification at 4q35 were selected with a specific high stringency PCR. Expression analyses revealed that engineered clones were able to transcribe for Flag-FRG2 fusion transcript which was higher in response to DNA damaging drugs, paralleling our previous results obtained with the endogenous gene. Interestingly, although the fusion transcript was observed, in western blot analysis we were not able to detect the fusion protein in the same conditions.
These results, together with further analysis of FRG2 gene features, globally revealed that FRG2a is not a coding gene but a lncRNA, whose function is still to be elucidated.
These data globally redefine FRG2 paradigma, leading to better comprehension of its function and role in FSHD pathogenesis.
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