Riassunto analitico
The CRISPR-Cas9 system is a genome editing tool derived from prokaryotes that became widely used in the past few years for the generation of site-specific genomic modifications in cell lines or even entire organisms. Although this system is programmed to recognize and to cut a specific DNA target sequence, it can also cleave off-target regions in the genome that present a similar DNA sequence. The cleavage of off-target regions can occur at a higher or lower frequency rate compared to on-target regions and could generate unwanted effects that need to be carefully considered when designing gene therapy strategies based on the CRISPR-Cas9 technology. Therefore, before its application in clinical trials, it is essential to investigate and determine the safety of the CRISPR-Cas9 system in terms of number and frequency of off-target events. The genome-wide unbiased identification of double-strand breaks (DSBs) enabled by sequencing (GUIDE-seq) is a new in vitro approach to detect the genome editing activity of the CRISPR-Cas9 system. This technique allows the genome-wide identification of off-target sites through the integration of double stranded oligodeoxynucleotide (dsODNs) into DSBs within the genome by non-homologous end joining (NHEJ). The selective amplification and sequencing of only those genomic fragments with integrated dsODNs allow to identify CRISPR-Cas9 cleavage sites genome-wide. In this study, we performed a bioinformatics analysis of GUIDE-seq data using two different tools, the “guideseq” Python package and the “GUIDEseq” R/Bioconductor package, for the genome-wide detection and annotation of on- and off-target cleavage sites. We found that the “guideseq” Python package is able to detect more off-target sites than the “GUIDEseq” R/Bioconductor package, although the majority of off-target sites are shared between two packages. Moreover, we analyzed publicly available histone modification profiles to evaluate the chromatin context in which the cleavage of off-target regions occurred. In fact, different cell types have different chromatin backgrounds that reflect cell type specific transcriptional programs and biological functions. The definition of chromatin states in different cell types allows to understand if different chromatin contexts could interfere with the ability of the CRISPR/Cas9 system to induce DSBs and if the off-target cuts fall in functionally relevant genomic regions such as enhancers or actively transcribed genes. We observed that the cleavage of most off-target sites occurs in quiescent chromatin regions devoid of any histone modification that characterize active regulatory elements. These results reveal that the use of epigenomic data is an effective approach to better characterize the impact of CRISPR/Cas9 off-targets.
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Abstract
Il sistema CRISPR/Cas9 è uno strumento per la modifica del genoma derivato dai procarioti ed è stato ampiamente utilizzato negli ultimi anni per generare modificazioni genomiche sito-specifiche in linee cellulari o in interi organismi. Sebbene questo sistema sia programmato per riconoscere e tagliare una specifica sequenza bersaglio nel DNA, definita sito on-target, può però tagliare anche in altre regioni del genoma che presentano una sequenza simile al sito on-target, dette siti off-target. Il taglio in regioni off-target può verificarsi con un tasso di frequenza più o meno elevato paragonato a regioni on-target, generando così effetti indesiderati che devono essere attentamente considerati quando si progettano strategie di terapia genica basate sulla tecnologia CRISPR/Cas9. Pertanto, prima della sua applicazione in studi clinici è essenziale indagare e determinare la sicurezza del sistema CRISPR/Cas9 in termini di numero e frequenza di eventi off-target.
La tecnologia GUIDE-seq è un nuovo approccio in vitro per rilevare l'attività di modifica del sistema CRISPR/Cas9 che permette l'identificazione imparziale su tutto il genoma delle rotture a doppio filamento (DSBs) del DNA attraverso sequenziamento. Questa tecnica consente l'identificazione a livello del genoma di siti off-target attraverso l'integrazione di oligodeossinucleotidi a doppio filamento (dsODNs) nei DSBs mediante la riparazione non omologa (NHEJ) del DNA. L'amplificazione selettiva e il sequenziamento solo di quei frammenti genomici in cui sono stati integrati i dsODNs consentono quindi di identificare i siti di taglio generati dal sistema CRISPR/Cas9 in tutto il genoma.
In questo studio, abbiamo eseguito un'analisi bioinformatica dei dati di GUIDE-seq utilizzando due diversi strumenti: il pacchetto Python "guideseq" e il pacchetto R Bioconductor "GUIDEseq", per il rilevamento e l'annotazione genomica dei siti di taglio on e off-target. Abbiamo scoperto che il pacchetto Python "guideseq" è in grado di rilevare più siti off-target rispetto al pacchetto R/Bioconductor "GUIDEseq", sebbene la maggior parte dei siti off-target sia condivisa tra i due pacchetti.
Inoltre, abbiamo analizzato profili di modificazioni istoniche (da dati pubblici) per valutare il contesto della cromatina in cui si sono verificati dei tagli off-target. Diversi tipi cellulari hanno infatti diversi background cromatinici che riflettono programmi trascrizionali e funzioni biologiche specifiche per ciascun tipo cellulare. Quindi la definizione degli stati della cromatina in diversi tipi cellulari consente di capire se contesti diversi di questa potrebbero interferire con la capacità del sistema CRISPR/Cas9 di indurre DSBs e se i tagli off-target avvengano in regioni genomiche funzionalmente rilevanti come enhancers o geni attivamente trascritti. Abbiamo osservato che la maggior parte dei siti di taglio off-target si verifica in regioni cromatiniche inattive, prive di qualsiasi modificazione istonica che caratterizzi elementi regolatori attivi. Questi risultati dimostrano che l'uso di dati epigenomici è un approccio efficace per caratterizzare meglio l'impatto dei siti off-target generati dal sistema CRISPR/Cas9.
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