Riassunto analitico
Il Pigment Epithelium Derived Factor (PEDF) e’ una glicoproteina secreta di 50kDa appartenente alla superfamiglia delle serpine non inibitorie (inibitori delle serinproteasi). Nell’uomo il suo gene (SERPINF1) e’ situato sul cromosoma 17p13.3. Il PEDF interagisce con le componenti della matrice extracellulare ed e’ rilevabile nel sangue e nella matrice interfotorecettoriale, mentre il suo mRNA e’ ampiamente espresso in tutto l’organismo denotando molteplici attivita’ biologiche. In particolare presenta due regioni peptidiche, una di 34aa e una di 44aa, che mediano rispettivamente un segnale antiangiogenico e uno neurotrofico. I recettori specifici del PEDF (PEDF-R) non sono stati ancora identificati con certezza ma ne sono stati proposti due: uno di 80kDa (PEDF-Rn) localizzato sui motoneuroni, che presenta un’elevata affinita’ per la regione di 44aa coinvolta nella segnalazione neurotrofica e uno di 60kDa (PEDF-Ra) localizzato sulle cellule endoteliali, con alta affinita’ per la regione di 34aa che media il segnale antiangiogenico. Inoltre, altri possibili recettori sono il PNPLA2 (ATGL), i recettori delle laminine, la F1-ATPasi/sintasi e la low-density lipoprotein receptor-related protein 6 (LRP6), tuttavia il quadro non e’ completo e sono necessari ulteriori approfondimenti. Il PEDF e’ una fattore molto versatile e mostra proprieta’ antiangiogeniche, antipermeabilizzanti, antiaterosclerotiche, antitumorigeniche, antiossidanti, antinfiammatorie, antitrombotiche, neurotrofiche e neuroprotettive. L’attivita’ antiangiogenica e’ selettiva per vasi in formazione senza influenzare quelli preesistenti, e sembra essere reversibile in determinate condizioni, come il danno tissutale. Ciononostante, il suo utilizzo in clinica e’ limitato a causa dell’instabilita’ e della breve emivita. Per questo motivo e’ importante lo sviluppo di terapie efficaci e applicabili estesamente e la terapia genica costituisce un approccio promettente rappresentando una soluzione pratica ed efficiente in termine di costi per la veicolazione continua di agenti antiangiogenici. Le cellule mesenchimali stromali/staminali (MSC) sono una popolazione di cellule multipotenti e autorinnovanti, rinvenute in molti tessuti adulti e sono state utilizzate come veicoli per molecole antitumorali. La capacita’ delle MSC di differenziare in una varieta’ di tipi cellulari, cosi’ come il loro elevato potenziale proliferativo ex vivo, le rende un interessante strumento terapeutico per la terapia cellulare e l’ingegneria tissutale. Le MSC possono essere facilmente trasdotte con vettori virali allo scopo di esprimere con elevata efficienza un’ampia gamma di proteine citoplasmatiche, di membrana e secrete. Basandoci su questi presupposti, abbiamo generato un vettore retrovirale codificante il gene umano del PEDF (MIGR1-PEDF-GFP) che e’ stato quindi trasfettato transientemente in cellule 293T. I surnatanti virali ottenuti sono stati utilizzati per infettare la linea cellulare di packaging FLYRD18, che a sua volta ha consentito l’infezione stabile delle MSC umane da tessuto adiposo (AD MSC) isolate da diversi donatori. La caratterizzazione immunofenotipica delle AD MSC e’ stata effettuata tramite FACS e i livelli di mRNA del PEDF nelle cellule infettate sono stati verificati con PCR real time dopo retrotrascrizione. Inoltre la quantita’ di PEDF secreto e’ stata valutata in ELISA e il potenziale proliferativo e’ stato determinato sulla base del livello del Ki67. Le AD MSC modificate sono anche in grado di differenziare in diversi lineage cellulari. Abbiamo inoltre analizzato l’espressione dei geni legati all’osteogenesi dopo l’induzione del differenziamento delle AD MSC (sia wild type che modificate geneticamente). Complessivamente i nostri dati suggeriscono che le MSC adulte possano veicolare il PEDF e quindi rappresentare uno strumento terapeutico versatile in patologie in cui il PEDF puo’ giocare un ruolo.
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Abstract
Pigment epithelium-derived factor (PEDF) is a 50kDa secreted glycoprotein and is a non-inhibitory member of the serpin (serine protease inhibitor) superfamily of proteins. Its gene (SERPINF1) is located in humans on chromosome 17p13.3. PEDF interacts with components of the ECM. PEDF is found extracellularly in blood and interphotoreceptor matrix while its mRNA is widely expressed throughout the human body exhibiting multiple and varied biological activities. Most importantly, PEDF contains two peptide regions, 34-mer and 44-mer, for anti-angiogenic and neurotrophic signaling interactions, respectively. Little is known about the identification of PEDF-Rs however, two distinct receptors are proposed for PEDF: an 80 kDa PEDF putative receptor (PEDF-Rn) localized on motor neurons with high affinity to the 44-mer PEDF peptide involved in neurotrophic activity and a 60 kDa PEDF putative receptor (PEDF-Ra) localized on endothelial cells with high affinity to the 34-mer PEDF peptide involved in anti-angiogenesis. Moreover, PEDF-R encoded by PNPLA2 (also known as ATGL), laminin receptor, F1-ATPase/synthase and low-density lipoprotein receptor-related protein 6 (LRP6) also have been identified though there are still missing pieces of the puzzle that are yet to be explored. PEDF has been described as a multifaceted protein with anti-angiogenic, anti-permeability, antiatherosclerosis, antitumorigenic, antioxidant, anti-inflammatory, antithrombotic, neurotrophic and neuroprotective properties. The anti-angiogenic activity of PEDF is selective because it is effective against newly forming vessels but spares existing ones, and the inhibitory effect of PEDF on vessel formation appears to be reversible in situations including tissue repair after injury. However, use of PEDF protein in clinic might be restricted because of its instability and short half-life. Thus, efforts should be made to develop effective and wide-applied strategy, and one potential solution for this is gene therapy. Gene therapy–mediated expression is a practical and potentially cost-effective method for chronic delivery of anti-angiogenic agents. Mesenchymal stromal/stem cells (MSC) are multipotent, self-renewing cells that can be found in almost all postnatal organs and tissues and have been exploited as delivery vehicles to target antitumor agents to malignant cells. The ability of MSC to differentiate into a variety of cell types as well as their high ex vivo expansion potential makes them an attractive therapeutic tool for cell transplantation and tissue engineering. MSC can be readily transduced by viral vector systems to efficiently express a wide range of cytoplasmic, membrane-bound and secreted protein products. Keeping above literature in mind we first generated a retroviral vector coding for human PEDF gene (MIGR1-PEDF-GFP). Our vector was transiently transfected into 293T cells. Viral supernatant obtained from 293T cells was used to infect FLYRD18 packaging cell line. Retroviral supernatant obtained from FLYRD18 cells was then used to stably infect human AD MSC samples obtained from multiple donors. Characterization by immunophenotype of AD MSC samples was performed by FACS. PEDF mRNA transcript levels in transduced cells was verified by real-time PCR after retro-transcription. Secreted levels of PEDF protein from genetically modified AD MSC were measured by ELISA. Proliferative rate of gene modified AD MSC samples were determined by Ki67 levels. Our gene modified AD MSC were also able to differentiate into different lineages. We analyzed the expression of osteogenic related genes after induction of osteogenic differentiation in our AD MSC samples (wild type and gene modified). Collectively our data suggests that adult MSC can deliver PEDF thus representing a multipurpose therapeutic tool in pathological concept where PEDF function has been reported.
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