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Le malattie mieloproliferative (MPN) sono disfunzioni clonali del sistema ematopoietico che derivano dalla deregolazione della cellula staminale. Si suddividono in: Policitemia vera (PV), Mileofibrosi primaria (PMF) e Trombocitemia Essenziale (ET).
Sebbene siano entità clinicopatologiche ben distinte, ad oggi, non è ancora possibile classificarle dal punto di vista molecolare, né individuare un rapporto preciso genotipo-fenotipo. Le mutazioni ormai note JAK2V617F, MPLW515L e le mutazioni di tipo I e II di CALR, non bastano a tracciare un esaustivo profilo mutazionale.
Al fine di descrivere in maniera più dettagliata il profilo molecolare dei pazienti affetti da MPN, abbiamo utilizzato la tecnologia del Next Generation Sequencing (NGS) con diversi approcci, in termini di applicazioni e piattaforme.
Durante questo progetto di tesi sono stati esplorati tre diversi campi: la ricerca, la scoperta e l’applicazione clinica.
RICERCA. Abbiamo partecipato alla seconda fase di uno studio internazionale chiamato IRON (Interlaboratory RObustness of Next generation sequencing) finalizzato a dimostrare la robustezza e la riproducibilità dell’ NGS. Sono stati costituiti diversi gruppi di lavoro, tra cui il gruppo delle malattie mieloproliferative e delle sindromi mielodisplastiche, a cui abbiamo preso parte. 9 geni precedentemente noti in letteratura per essere mutati in malattie ematologiche e implicati nella progressione e nella sopravvivenza sono stati sequenziati in 155 pazienti con PMF.
Lo screening mutazionale ha permesso di dimostrare che l’analisi in deep sequencing di pochi geni candidati supporta un progetto di più ampia caratterizzazione delle PMF da un punto di vista molecolare.
SCOPERTA. Con lo scopo di identificare nuovi geni non ancora caratterizzati abbiamo disegnato un pannello per esaminare 2000 geni e microRNA associati al cancro. Inizialmente il pannello è servito per analizzare il DNA genomico (estratto dai granulociti e dai linfociti CD3+ espansi in-vitro) di 20 pazienti affetti da MPN. 141 mutazioni somatiche mai descritte precedentemente sono state identificate. Per verificarne la ricorrenza è stata esaminata una coorte più ampia di 189 pazienti. Oltre ai geni già noti per essere coinvolti nelle MPN, sono stati individuati 8 geni mai descritti prima, che presentavano una ricorrenza di mutazione con frequenze che tra il 3 e l’8%.
Abbiamo inoltre osservato che le mutazioni del codone 12 di NRAS (NRASG12V ed NRASG12D), nel caso della PMF, erano significativamente associate alla categoria di rischio più alta (DIPSS-plus score). Osservazione confermata in una coorte aggiuntiva di 66 casi.
APPLICAZIONE CLINICA. Due studi clinici di fase III (COMFORT-I e COMFORT-II - COntrolled MyeloFibrosis Study with ORal JAK Inhibitor Therapy) hanno portato all’approvazion del Ruxolitinib, un inibitore di JAK1 e 2, per il trattamento di splenomegalia malattia-dipendente in pazienti adulti con MF, PPV-MF (Mielofibrosi – Post Policitemia Vera) o PET- MF (Mielofibrosi – Post Trombocitemia Essenziale).
In collaborazione con il laboratorio del dipartimento di medicina clinica e sperimentale dell’università di Firenze (che ha condotto lo studio) è stata effettuata un’analisi mutazionale in 166 pazienti arruolati, di 14 geni correlati alla mielofibrosi. È stato osservato che la splenomegalia ed il rischio di sviluppare anemia e trombocitopenia causate dal ruxolitinib si verificavano con frequenze simili in diversi profili mutazionali. Il ruxolitinib riduceva però il rischio di morte in pazienti con una set di mutazioni sfavorevoli (ASXL1, EZH2, SRSF2, IDH1/2). Questi dati indicano che la classificazione molecolare dei pazienti può aiutare a predire l’efficacia clinica e la sopravvivenza nel trattamento con ruxolitinib.

Myeloproliferative neoplasm (MPN) are clonal hematologic disorders, stem-cell derived. They are divided in: Polycytemia Vera (PV), Primary myelofibrosis (PMF) and Essential Thromocytemia (ET). Although well defined clinical entities, the molecular classification and the precise genotype-phenotype correlation is not well established yet. Apart from the well known JAK2V617F, MPLW515L and CALR Type-I and Type-II mutations, a complete mutational landscape for these pathologies has not been depicted yet. In order to realize a comprehensive study of MPN molecular profiling, we used different Next Generation Sequencing (NGS) approaches, in terms of platforms and applications. A “multi-approach” study, may help in assessing the mutational rate of genes already known from the literature, rather than to discover new genes, possibly involved in MPN onset, progression, leukemic transformation or drug response. Three different topics have been explored during this work: the research, the discovery and the clinical application. RESEARCH. We took part to the second phase of an international study named IRON (Interlaboratory RObustness of Next generation sequencing) aimed at demonstrating the robustness and reproducibility of NGS. For this phase of the study, distinct working groups (for different hematological malignancies) have been established, including the Myelodisplastic/Myeloproliferative Neoplasm working group that we represent. We selected 9 genes, known from the literature to be mutated in hematological malignancies and important for disease progression or survival and studied the occurrence of mutations in 155 PMF patients. The mutational screening demonstrated with this first application, that deep-sequencing analysis of few candidate genes support a further characterization of MF on a molecular level. DISCOVERY. With the aim of further investigating the involvement of previously unknown genes in MPN onset and progression, we designed a target enrichment panel composed of 2000 cancer associated genes and microRNAs. The genomic DNA of granulocytes and in vitro-expanded CD3+ T-lymphocytes, was target-enriched and sequenced in a learning cohort of 20 MPN patients. We identified 141 genuine somatic mutations, most of which were not previously described. To test the frequency and the recurrence of the identified variants, a larger validation cohort of 189 MPN patients was additionally screened. Excluding the genes already described in MPN, for 8 genes we demonstrated a mutation frequency between 3 and 8%. We also found that mutations at codon 12 of NRAS (NRASG12V and NRASG12D) were significantly associated, for PMF, with highest dynamic international prognostic scoring system (DIPSS)-plus score categories. This association was then confirmed in 66 additional PMF patients. CLINICAL APPLICATION. Two pivotal phase III trials (COMFORT-I and COMFORT-II) supported the approval of Ruxolitinib, a JAK1 e 2 inhibitor, for the treatment of disease-related splenomegaly or symptoms in adult patients with MF, PPV-MF (Post Polycytemia Vera-Myelofibrosis) or PET-MF (Post Essential Thrombocytemia – Myelofibrosis) We collaborated with the Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, that conducted the study. Within COMFORT-II (COntrolled MyeloFibrosis Study with ORal JAK Inhibitor Therapy), we performed a comprehensive mutation analysis of 14 MF-related genes and their impact on clinical response of 166 patients included in the study. It has been observed that splenomegaly and symptoms, as well as the risk of developing ruxolitinib-associated anemia and thrombocytopenia, occurred at similar frequencies across different mutation profiles. Ruxolitinb reduced the risk of death in patients harboring a set of unfavorable mutations (ASXL1, EZH2, SRSF2, IDH1/2). These date indicate that a molecular stratification of patients may predict clinical efficacy and survival improvement in ruxolitinib treatment