Riassunto analitico
Il melanoma è uno dei tumori più aggressivi della pelle e origina dai melanociti.Mentre negli stadi precoci viene rimosso chirurgicamente, il melanoma in fase avanzato ha esito generalmente fatale. Le Neurotrofine (NTs) sono un gruppo di molecole presenti a livello cutaneo che stimolano sia proliferazione cellulare che apoptosi.La famiglia delle NTs è formata da 4 membri ed esercita le proprie funzioni attraverso due recettori: i Trks e p75NTR. Mentre i recettori Trks promuovono sopravvivenza, il ruolo di p75NTR è ambiguo poichè può agire sia come co-recettore dei TRks, o indurrre da solo apoptosi. Come per altri fattori di crescita, il segnale mediato dalle NTs è spesso alterato nei tumori umani. Nel nostro laboratorio abbiamo già dimostrato che le linee cellululari di melanoma sintetizzano e secernono tutte le NTs ed esprimono entrambi i recettori (Truzzi et al,2008). Questi studi sono stati condotti su cellule di melanoma che crescono in adesione formando monostrati bidimensionali. Negli ultimi anni, è diventato sempre più evidente che la sopravvivenza cellulare e l'apoptosi dipendono strettamente dall'adesione e dalla matrice extracellulare. Inoltre, è stato dimostrato che i modelli tumorali tridimensionali mimano in modo più preciso il comportamento dei tumori solidi in vivo rappresentando un modello sperimentale realistico per studiare molti aspetti della biologia dei tumori. Per questi motivi,abbiamo deciso di studiare il comportamento del tumore utilizzando linee cellulari coltivate con modelli 3D come gli sferoidi tumorali e gli skin equivalent. Abbiamo impiegato i modelli 3D su 5 linee di melanoma che rappresentano diversi stadi di progressione e gradi di aggressività, al fine di valutare il ruolo dei recettori delle NTs nella progressione e nella capacità del tumore di invadere il microambiente. Come primo approccio al modello degli sferoidi abbiamo effettuato alcuni esperimenti preliminari confrontando le capacità di crescita, la proliferazione e le fasi del ciclo cellulare con il più noto modello 2D. Gli sferodi sono stati poi trasferiti in una matrice di collagene che mima il microambiente per valutare la loro capacità invasiva in assenza o in presenza di farmaci. Da questo primo set di esperimenti,le differenze osservate tra i due modelli ci hanno permesso di concludere che, in termini di crescita, capacità proliferative e apoptosi, il modello 3D degli sferoidi rispecchia in maniera più fedele la situazione in vivo. Inoltre gli sferoidi 3D riproducono le capacità di invasività e di resistenza farmacologica tipiche dello stadio del tumore che rappresentano. Per meglio caratterizzare gli sferoidi, abbiamo analizzato l'espressione dei Trks e p75NTR comparandoli nuovamente con il modello 2D. I livelli di espressione di p75NTR sono risultati inversamente correlati all'aggressività del tumore in entrambi i modelli.In particolare le 1205Lu (linea di melanoma metastatico molto aggressivo)esprimevano i livelli più bassi,mentre le WM115 (linea di melanoma primario scarsamente aggressivo)i livelli più alti. L'espressione di p75NTR è stata inoltre valutata negli skin equivalent confermando gli stessi risultati. Abbiamo quindi ipotizzato che l'espressione di p75NTR cali con l'aumentare dell'aggressività del tumore. Il successivo isolamento delle cellule p75NTR+ e p75NTR- da una linea di melanoma ha confermato questa ipotesi, rivelando che gli sferoidi p75NTR- proliferano di più e sono inoltre in grado di invadere maggiormente il microambiente degli sferoidi p75NTR+, denotando un comportamento più aggressivo e una più elevata predisposizione a metastatizzare. Per rafforzare ulteriormente questi dati, abbiamo silenziato p75NTR nella linea di melanoma meno aggressiva (WM115), e abbiamo osservato un fenotipo più aggressivo.Le cellule transfettate con siRNA-p75NTR mostravano un'aumentata capacità proliferativa, una ridotta espressione di integrina β1 e maggiori capacità di invasione.
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Abstract
Melanoma is one of the most aggressive types of skin cancer.While cutaneous melanoma is curable with surgical excision in its earliest stages, metastatic melanomas are generally fatal due to their marked metastatic potential and resistance to current treatments.Hence, understanding the mechanisms behind the progression of melanoma is of extreme importance in order to find new therapies. Neurotrophins (NTs) are a group of molecules that operate in skin where they take part in a complex network in which they stimulate both proliferation and apoptosis.The NT family consists of four members and exert their activities through two receptors: Trks and p75NTR. While Trks promote mostly survival and differentiation, the role of p75NTR is ambiguous, as it can either act as a co-receptor for Trks,or signal on its own by inducing apoptosis. Similarly to other growth factors, dysregulation of NTs signal transduction is found in a number of tumors.In our lab, we previously demonstrated that melanoma cell lines synthesize and secrete all NTs and express both receptors. However, melanoma cells used in this study, have been maintained as 2D monolayer cultures that adhere to an underlying substrate.In the last few years, it has become increasingly apparent that cell survival and apoptosis, strongly depend on cell adhesion and the extracellular matrix.It has also become clear that three-dimensional tumor models are able to mimick more closely the behavior of solid tumors in vivo representing a realistic experimental model to investigate many aspects of tumor biology.For this reason, we proposed to study the behavior of the tumor by using melanoma cell lines cultured in 3D models such as tumor spheroids and melanoma skin equivalents.In particular, we employed 5 melanoma cell lines, representing different stages of the tumor in order to investigate in 3Dmodels the role of NTs receptors during progression of melanoma and to evaluate if their expression could affect cell abilities to invade the microenvironment.To initially approach the 3D spheroids, we performed some preliminary tests to evaluate growth, proliferation and cell cycle analysis in comparison to the well-known 2D cultures. Moreover,spheroids were implanted into a matrix of collagen I which mimics tumor microenvironment in order to evaluate their invasive abilities in the presence or absence of drugs. From this first set of experiments, we observed numerous differences between the two models and we found that in terms of growth, proliferation and apoptosis 3D spheroids better reflect the in vivo situation. Furthermore,spheroids reproduce the invasive and drug resistance features of the tumor stage they represent.To better characterize 3D spheroids, we analyzed over time the expression of Trks and p75NTR receptors comparing 2D-monolayer culture to 3D-spheroids.Interestingly, p75NTR expression was found inversely correlated to progression of the tumor in both models;in particular, the metastatic melanoma 1205Lu cell line expressed the lowest level, while the primary poorly aggressive, WM115 cell line displayed the highest expression.p75NTR was also evaluated in 3D melanoma skin equivalents confirming the same results.For this reason, we postulate that p75NTR expression decreases with enhanced aggressiveness of the tumor.The subsequent isolation of p75NTR + and – subpopulations from one melanoma cell line confirmed this hypothesis,revealing that p75NTR- proliferate more than p75NTR+ spheroids,and are able to invade collagen I to a greater extent,indicating a more aggressive behavior and predisposition to metastasize.To strengthen the data, we silenced p75NTR expression in WM115, and we observed the acquisition of a more aggressive phenotype.In detail, WM115 siRNA-p75NTR cells showed a greater proliferative capacity, a reduced expression of the adhesion molecule integrin-β1 and an increased invasion abilities.
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