• angiogenesi
• MSC
• osso
• scaffold
• trasporto

Le diverse ricerche condotte sulle cellule staminali adulte (CSA), hanno identificato i tessuti fonti di tali cellule, la loro caratterizzazione immunofenotipica e la loro abilità di differenziarsi verso tipi cellulari mesenchimali e non. Tali evidenze hanno favorito l’introduzione delle CSA in applicazioni di medicina rigenerativa tramite lo sviluppo di modelli animali trapiantati con CSA sole o associate a supporti tridimensionali. Tali studi hanno evidenziato limiti che ancora non consentono l’utilizzo clinico delle CSA. (1) E’ necessario migliorare la vascolarizzazione dei trapianti: il nuovo tessuto, derivante dal costrutto ingegnerizzato, si forma esternamente al trapianto, vicino al tessuto sano già esistente e la scarsa vascolarizzazione del supporto tridimensionale causa la morte delle CSA. (2) Mancano procedure standardizzate per spedire le CSA: queste cellule devono essere espanse in condizioni di “good manufacturing practice (GMP)” all’interno di centri specializzati, pertanto si rende necessario uno studio degli effetti del trasporto delle CSA sulla loro funzionalità una volta trapiantate in vivo.
Il primo obiettivo di questa tesi è l’ottimizzazione della vascolarizzazione del trapianto tramite lo sviluppo di modello autologo di coniglio. CSA autologhe da tessuto adiposo (TA), positive per CD29, CD90 e CD49e, sono state associate ad un supporto tridimensionale biologico (STB) composto da liposuzione e un gel carrier a base di acido ialuronico. Abbiamo confrontato questo nuovo approccio con la tecnica di trasferimento di grasso autologo (TGA), una comune procedura per curare patologie del TA come traumi, ustioni, resezione post tumore e lipodistrofie. L’utilizzo delle CSA riduce in breve tempo la necrosi e favorisce la vascolarizzazione in modo significativo preservando l’architettura del TA. Dopo tre mesi, negli animali trattati con STB, si osserva un significativo aumento del TA con ottime caratteristiche istologiche.
Per studiare gli effetti del trasporto sulla funzionalità delle CSA, isolate da midollo osseo in centri GMP, abbiamo standardizzato un protocollo per spedire tali cellule, che ne preservasse la vitalità e il potenziale differenziativo. Abbiamo testato l’effetto di tre diverse soluzioni di trasporto (0,9% fisiologica, +/- albumina derivata da due diversi produttori), mimando una spedizione di 18 ore a +4°C riducendo la quantità di cellule e i volumi di reagenti ma mantenendo costante il loro rapporto per avere la possibile dose terapeutica. La vitalità cellulare dopo il trasporto è stata > 80% in tutti i casi, quindi sono stati valutati i seguenti parametri: proliferazione, adesione alla plastica e al biomateriale osteoconduttivo (HA/ß-TCP 3D); capacità differenziativa in senso osteogenico ex-vivo sia in un contesto bidimensionale (fiasca di coltura), sia sul biomateriale (HA/ß-TCP 3D) ed infine la formazione di osso ectopico in vivo dopo trapianto sottocute di CSA e HA/ß-TCP 3D in un modello murino immunodeficiente. Il trasporto a +4°C è stato il fattore chiave per il mantenimento della vitalità e funzionalità cellulare. Non sono state osservate differenze significative tra le soluzioni di trasporto confrontate relativamente ai parametri valutati. L’aggiunta di albumina non necessariamente migliora le caratteristiche delle CSA in termini di proliferazione, adesione e differenziamento osseo in vivo. In conclusione, considerando le nuove problematiche della medicina rigenerativa recentemente emerse, abbiamo dimostrato che le CSM derivate dal tessuto adiposo potrebbero migliorare la vascolarizzazione del trapianto e le CSM da midollo possono sopravvivere alle condizioni di trasporto differenziando in tessuto osseo in vivo. Questi risultati pre-clinici infondono ottimismo per continuare a migliorare la medicina rigenerativa espandendo il potenziale utilizzo clinico delle CSM.

Worldwide investigation of Mesenchymal Stem Cells (MSC) have identified tissue sources, immunophenotypic characteristics and their ability to differentiate to mesenchymal and non mesenchymal cell types. This potency encouraged the introduction of MSC in regenerative medicine applications, explored through the development of several animal models engrafted with MSC alone or in combination with scaffolds. Such pre-clinical studies have highlighted key limitations yet have not necessarily addressed all the challenges facing use of MSC in the clinic: (1) Improvements in graft vasculogenesis are needed. Typically, newly formed repair tissue derived by the engineered construct remained in the graft periphery, close to existant healthy tissue. Slow and deficient blood vessel infiltration into the scaffold was the likely cause of MSC death within the inner regions of the scaffold. (2) Appropriate cell shipment conditions are poorly characterized. The clinical prerequisite for human MSC expansion under good manufacturing practice (GMP) in specialized facilities, perhaps far from the operating theatre, increases the importance of understanding the impact of transportation on functional outcome in vivo. The first goal of this thesis was to explore the vascularization of the graft by development of an autologous rabbit model. Autologous ex-vivo CD29+, CD90+, CD49e+ MSC isolated from adipose tissue (AT)were combined with a living biological scaffold (LBC) obtained trough liposuction and hyaluronic acid-based gel used as a carrier. We compared this new approach with Autologous fat transfer (AFT), a common surgical procedure for adipose tissue repair in trauma, burns, post-tumor resections and lipodystrophies. Use of MSC promptly reduced AFT necrosis and significantly increased vasculogenesis whilst preserving the transplanted AT architecture. After three months we observed significant volume preservation in animals treated with LBC, again associated with better histological features. To explore the influence of transportation on MSC function, we standardized a protocol to ship human bone marrow GMP MSC with the aim of preserving viability and differentiation potential. Scaled-down experiments mimicking shipment for 18 hours at 4°C, used cell densities equivalent to those anticipated for therapeutic use to test the influence of three different clinical grade transportation buffers (0.9% saline +/- 4% albumin from two independent sources) versus cell maintenance medium. Cell viability post shipment conditions was >80% in all cases allowing evaluation of the following cGMP-MSC phenotypes: Proliferation rate; adhesion to plastic and hydroxyapatite tricalcium phosphate osteoconductive biomaterial (HA/ß-TCP 3D, a suitable 3D scaffold for bone regneration); ex vivo osteogenic differentiation in contexts of 2D monolayers on plastic and HA/ß-TCP 3D scaffolds and in vivo ectopic bone formation after subcutaneous implantation of cells with HA/ß-TCP scaffold into NOD/SCID mice. A cold transportation temperature close to 4°C was key for maintaining good cell viability and function. Among the compared transport buffers, no significant differences were observed for the parameters evaluated and when cells were kept cold, addition of human albumin didn’t necessarily improve MSC phenotype in term of proliferation, adhesion or in vivo bone differentiation. In conclusion, addressing the challenges facing regenerative medicine today, we have shown that adipose derived MSC may help to improve graft vasculogenesis and bone marrow MSC can sustain clinical grade shipping conditions making bone in vivo. These pre-clinical results provide optimism for continued improvements in translational regenerative medicine and expand the potential clinical use of MSC.