Riassunto analitico
Tra i diversi approcci di medicina rigenerativa, c’è un crescente interesse riguardo all’utilizzo di cellule staminali mesenchimali (CSM) umane autologhe per aumentare la riparazione del tessuto osseo. Facendo parte di un consorzio europeo per la rigenerazione ossea, ci siamo occupati di valutare il potenziale osteogenico di cellule primarie di midollo osseo (MO) umano, isolate ed espanse in vitro secondo criteri “current grade manufacturing procedure” (CSM-MO-cGMP). In tale contesto, il nostro fine è stato quello di standardizzare un approccio funzionale che fosse rapido, riproducibile e facilmente applicabile.
In letteratura numerosi geni sono stati associati alla cascata delle modificazioni geniche necessarie per il differenziamento osteogenico. Attraverso l’espressione di questi geni nelle CSM differenziate ex vivo raramente si riesce a predire la formazione dell’osso in vivo, ma recenti studi su CSM immortalizzate hanno individuato alcune correlazioni. Il nostro fine era comprendere se tali cambiamenti dell’espressione genica fossero applicabili anche in contesti differenti: (1) utilizzando CSM primarie; (2) impiegando un terreno di coltura addizionato di lisato piastrinico (LP) al posto del siero fetale bovino (SFB) e (3) applicando tali marker genici dopo il differenziamento osteogenico in vitro in 1 settimana anziché in 2.
Sono stati testati 6 campioni di CSM-MO-cGMP indotti in senso osseo per valutare la mineralizzazione della matrice ex vivo. Di questi, quattro campioni sono risultati positivi per la colorazione Alizarin Red S (ALZ) e tre positivi per la colorazione di Von Kossa (VK). Dall’analisi istologica del trapianto in vivo per 6 settimane delle CSM-MO-cGMP in topi immunocompromessi è emerso che in quattro casi si è generata un’area di neoformazione ossea superiore al 15% dell’area totale della sezione. In particolare, il fenotipo della mineralizzazione della matrice ex vivo dopo due settimane di induzione ossea correla con la formazione in vivo di osso solo nel 50% dei campioni. Abbiamo testato un pannello di 12 geni considerati marcatori osteogenetici e dopo una settimana di induzione in vitro in senso osseo, sono stati identificati un gruppo di geni con una variazione statisticamente significativa nei livelli di espressione correlati con la mineralizzazione ex vivo. Non sono state rilevate correlazioni dirette tra l’espressione di singoli geni e la formazione di osso. Tuttavia, considerando l’analisi dei gruppi di 5 geni più espressi, siamo riusciti ad individuare i due donatori di CSM con la minor potenzialità di formare tessuto osseo in vivo, suggerendo il possibile utilizzo di tale approccio a supporto della sperimentazione clinica.
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Abstract
Among diverse approaches in translational medicine, there is growing interest in use of autologous mesenchymal stem cells (hMSC) to enhance bone regeneration. Working within a European consortium, we aimed to evaluate the osteogenic potency of primary bone marrow- (BM) hMSC cultures isolated and expanded by clinical grade procedures (cGMP-BM-hMSC). Conforming to this context, we aimed to standardize a functional assay that was rapid, reproducible and readily applicable.
Historically, numerous genes have been associated with the cascade of genetic changes required for osteogenic differentiation. Though expression of these genes in differentiated hMSC ex vivo rarely predict in vivo bone formation, recent studies using immortalized hMSC, have shown some correlations. We wished to explore whether such gene expression changes could also be applicable in different contexts: (1) using primary hMSC; (2) with growth medium supplemented by platelet lysate (PL) instead of fetal bovine serum (FBS) and (3) at 1 week instead of 2 weeks time points.
Testing six cGMP-BM-hMSC samples for osteogenesis by ex vivo cellular matrix mineralization stainings, only four were positive for alizarin Red S (ALZ) and only three for Von Kossa (VK). Four of these donors generated ≥15% new bone area in histological sections from bone formation assays in immunodeficient mice after 6 weeks. Notably, the ex vivo phenotype of matrix mineralization staining at two weeks only correlated well with in vivo bone formation in 50% of the samples. When testing a panel of twelve osteogenic biomarker genes after one week of osteogenic induction, a subset of genes showed statistically significant changes in expression level that correlated with ex vivo mineralization. No direct correlation between expression and bone formation was found for any individual gene. Nonetheless, cluster analyses among five consistently expressed genes distinguished the two donors with least bone forming potential, suggesting this approach may prove helpful for clinical trials.
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