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• GEP
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Mielofibrosi primaria (PMF), policitemia vera e trombocitemia essenziale sono neoplasie mieloproliferative croniche Philadelphia-negative (MPNs) caratterizzate da una proliferazione clonale che origina dalla cellula staminale e aumentata produzione di cellule mieloidi mature. La PMF è la peggiore fra le MPNs ed è associata con anomala megacariopoiesi, iperproduzione di citochine, fibrosi del midollo osseo (BM), osteosclerosi, angiogenesi ed emopoiesi epatosplenica.
Le informazioni sulle anomalie molecolari delle MPNs sono state limitate fino al 2005 quando fu scoperta la mutazione con guadagno di funzione a carico di JAK2. Da allora molti altri geni mutati sono stati individuati, ciò nonostante essi non rappresentano l’evento mutazionale iniziante ed è chiaro che le basi molecolari delle MPNs non sono state ancora completamente elucidate.
Recentemente, sono stati proposti diversi meccanismi molecolari patogenetici, come l’espressione aberrante di RNAs codificanti e non codificanti.
Per approfondire questo argomento, nella prima fase del progetto abbiamo investigato l’ impronta molecolare di cellule CD34+ in pazienti con PMF, realizzando il profilo di espressione genico su 42 campioni di PMF e 31 controlli sani.
Abbiamo identificato molti geni deregolati potenzialmente coinvolti in alcuni aspetti patogenetici della PMF, come geni correlati con fibrosi del BM (es. MMP9 e TIMP3), regolazione della migrazione cellulare (es. TM4SF1 e MMP8), numerosi fattori di trascrizione e rimodellatori della cromatina coinvolti nel differenziamento mieloide e megacariocitario (es. AFF3, MAF e IKZF2). I campioni di PMF hanno mostrato, inoltre, livelli aumentati di mRNAs adatti come biomarkers o putativi targets molecolari per scopi diagnostici o prognostici. L’espressione dei geni maggiormente upregolati (LCN2, OLFM4, ANXA3, FGR, e LEPR) è stata validata anche su granulociti di PMF, così come i livelli di proteina secreta (OLFM4 e LCN2) sono stati valutati nel siero dei pazienti. I risultati hanno mostrato che questi geni potrebbero essere considerati biomarkers di malattia, in quanto significativamente più elevati nei pazienti.
I geni downregolati, invece, sono stati silenziati in cellule CD34+ normali per costruire modelli di PMF in vitro. Tra questi geni, ci siamo focalizzati sul rimodellatore della cromatina JARID2, in quanto questo processo è frequentemente compromesso nelle MPNs. I nostri dati hanno mostrato che il silenziamento di JARID2 forza il differenziamento emopoietico verso il lineage megacariocitario. Sulla base di tali risultati abbiamo ipotizzato che la downregolazione di JARID2 nelle cellule CD34+ di PMF potrebbe essere coinvolta nella megacariopoiesi anomala che caratterizza questa patologia.
Infine, dato che i lunghi RNAs non-codificanti (lncRNAs) stanno emergendo come regolatori chiave dell’espressione genica in cellule normali e neoplastiche, abbiamo investigato l’espressione dei lncRNAs ANRIL, MEG3 e WT1-antisense (as), già descritti come coinvolti in neoplasie ematologiche, in cellule CD34+ di una diversa coorte di pazienti con PMF. I risultati hanno evidenziato che la maggioranza dei campioni di PMF mostra una co-upregolazione di WT1 e WT1-as rispetto ai controlli. Questi campioni mostrano anche il concomitante aumento di espressione di MEG3. In questi pazienti abbiamo trovato una correlazione fa i livelli di espressione di WT1/WT1-as/MEG3 e il punteggio del Dynamic International Prognostic Scoring System (DIPSS)-plus ed un elevato numero di cellule CD34+ circolanti. In aggiunta il pattern di espressione di CDKN2B/ANRIL ha discriminato un gruppo di pazienti con upregolazione di CDKN2B, e tra questi un sottogruppo con ANRIL downregolato. In particolare, questo gruppo di pazienti presenta un alto grado di fibrosi del BM e la mutazione JAK2V617F. I nostri risultati suggeriscono che anche la deregolata espressione di lncRNAs potrebbe avere un ruolo nella patogenesi e nella progressione della PMF

Primary myelofibrosis (PMF), polycythemia vera and essential thrombocythemia are Philadelphia-negative chronic myeloproliferative neoplasms (MPNs) characterized by stem cell-derived clonal proliferation and increased production of mature myeloid cells. PMF is the worst among the MPNs and is associated with abnormal megakaryopoiesis, cytokine overproduction, bone marrow (BM) fibrosis, osteosclerosis, angiogenesis and hepatosplenic hematopoiesis. Information on molecular abnormalities of MPNs has been scanty until 2005 with the discovery of the somatic gain-of-function mutation of JAK2. Since then, many other mutated genes were identified, nevertheless they do not represent the primary mutational event and it is clear that the molecular basis of MPNs have not yet been completely elucidated. Recently, several new molecular pathogenetic mechanisms were proposed, such as the aberrant expression of coding and non-coding RNAs. In order to address this issue, in the first phase of this project we investigated the molecular signature of CD34+ cells from PMF patients, performing gene expression profiling of 42 PMF samples and 31 healthy controls. Interestingly, we found many deregulated genes possibly involved in some pathogenetic steps of PMF such as genes related to BM fibrosis (MMP9 and TIMP3) or regulation of cell migration (TM4SF1 and MMP8) as well as a number of transcription factors and chromatin remodelers implicated in myeloid and megakaryocyte commitment (i.e. AFF3, MAF and IKZF2). Moreover, PMF samples exhibited increased levels of several mRNAs suitable as biomarkers or as putative molecular targets for diagnostic or prognostic purposes. Then the expression of the most upregulated genes (LCN2, OLFM4, ANXA3, FGR and LEPR) was validated also in PMF granulocytes, as well as secreted protein (OLFM4 and LCN2) levels were assessed on patients’ serum. These findings demonstrate that these genes could be considered as disease biomarkers, since they were significantly higher in patients. Conversely, downregulated genes have been silenced in normal CD34+ cells in order to construct in vitro PMF models and to elucidate the possible role in the hematopoietic differentiation. Among those genes, we focused on the chromatin remodeler JARID2, because chromatin remodeling is a process frequently impaired in MPNs. Our data demonstrated that JARID2 silencing enforces the hematopoietic differentiation towards the megakaryocytic lineage. Based on these results we suppose that the downregulation of JARID2 in CD34+ cells from PMF patients could be involved in the abnormal megakaryopoiesis that features this disease. Finally, since long non-coding RNAs (lncRNAs) are emerging as key regulators of gene expression in normal and cancer cells, we decided to investigate the expression of ANRIL, MEG3 and WT1-antisense lncRNAs, previously described as related to hematological malignancies, in CD34+ cells from a different cohort of PMF patients. The results evidenced that the majority of PMF samples displayed a co-upregulation of WT1 and its antisense RNA compared to controls. These samples also showed an increased MEG3 expression. In these patients, we found a correlation with WT1/WT1-as/MEG3 expression levels and high Dynamic International Prognostic Scoring System (DIPPS) plus score and elevated number of circulating CD34+ cells. Moreover, the expression pattern of CDKN2B/ANRIL distinguished a group of patients characterized by an upregulation of CDKN2B, and among these, a subgroup with downregulated ANRIL. Of note, this group of patients exhibited a high grade of BM fibrosis and the presence of JAK2V617F mutation. Our results suggest that also a deregulated expression of these lncRNAs could play a role in PMF pathogenesis and progression.