Riassunto analitico
Nonostante l'estesa sopravvivenza in vivo, le cellule di leucemia linfatica cronica (LLC), muoiono rapidamente in condizioni di coltura in vitro. Questa osservazione suggerisce che la resistenza all’apoptosi non è una caratteristica intrinseca delle cellule B leucemiche, ma che fattori estrinseci sono necessari nel mediare la prolungata sopravvivenza. Nel microambiente, le cellule LLC interagiscono con diverse cellule accessorie che forniscono segnali di sopravvivenza, di proliferazione e di farmaco-resistenza. L'asse endotelinico, comprendente le endoteline (ET-1, ET-2 e ET-3) e i recettori (ETAR e ETBR), è recentemente molto studiato per la sua implicazione nella crescita tumorale dove regola diversi meccanismi come la mitogenesi, la sopravvivenza cellulare, l'angiogenesi, l’infiltrazione tumorale di cellule immunitarie e l’invasione. Questo studio è stato progettato al fine di determinare il coinvolgimento della via di segnalazione di Endotelina-1 nel dialogo cellulare tra le cellule leucemiche e le cellule endoteliali, nel mantenimento e nella progressione della LLC. Il contatto diretto con cellule endoteliali in vitro, determina nelle cellule LLC una significativa riduzione dell’apoptosi spontanea e indotta da farmaci così come una consistente modulazione trascrizionale. Uno dei geni maggiormente up-regolati nelle cellule LLC dopo co-coltura con cellule endoteliali è ET-1 (p<0.05). Inoltre, un aumento della secrezione di ET-1 nel terreno condizionato da 0.6±0.1 pg/mL quando le cellule LLC sono coltivate da sole a 51,6±0,5 pg/mL è stato misurato nel sistema coculturale (p<0,05). Le cellule LLC circolanti nel sangue periferico e infiltranti i tessuti producono ET-1 ed esprimono alti livelli del recettore di tipo A sulla superficie cellulare (ETAR) rispetto a controlli sani, indicando che l'asse ET-1/ETAR potrebbe essere un meccanismo peculiare delle cellule leucemiche. L’aggiunta del peptide ricombinante di ET-1 alle cellule di LLC in coltura da sole determina un aumento significativo della sopravvivenza cellulare (p<0,05). Mentre il blocco di ETAR attraverso l’antagonista selettivo BQ123 annulla la resistenza all’apoptosi mediata da ET-1. La stimolazione di cellule LLC con ET-1 induce l'attivazione delle vie di segnalazione di PI3K/AKT e ERK/MAPK e aumenta l'attivazione metabolica delle cellule leucemiche rispetto al controllo non stimolato (p=0,018). Al contrario, BQ123 inibisce la fosforilazione delle proteine Akt e Erk e l’attivazione intracellulare mediata da ET-1. Inoltre, il contatto diretto tra cellule LLC, e il monostrato endoteliale aumenta il numero di cellule in divisione cellulare, effetto che viene significativamente ridotto dal pretrattamento delle cellule con BQ123 (p=0.003). Inoltre, misurando i livelli del precursore di ET-1 (big ET-1) in campioni di plasma raccolti da una coorte multicentrica di pazienti LLC (n=101) con saggio ELISA; elevati livelli di big ET-1 sono stati rilevati nei pazienti con stadio avanzato(p=0,004), alta microglobulina β2 (p<0.0001), lo stato IGHV non mutato (p=0,003), e intermedio/alto rischio FISH (p=0,002). I pazienti con alti livelli di big ET-1 (≥5,4 pg/mL) hanno mostrato un più breve tempo dal primo trattamento (TTFT, p=0,005). Inoltre, variazioni dei livelli plasmatici di big ET-1 tra campioni seriali di plasma sono state misurate in pazienti con progressione della malattia. Complessivamente, questi risultati descrivono il ruolo della via di segnalazione ET-1/ETAR nella prolungata sopravvivenza delle cellule LLC e nell'interazione con le cellule endoteliali, suggerendo che ET-1 possa effettivamente contribuire alla creazione di una nicchia protettiva nei tessuti infiltrati. Inoltre, ET-1 media l’attivazione cellulare e veicola segnali proliferativi alle cellule LLC che vengono bloccati dall'inibizione selettiva di ETAR. In vivo, livelli plasmatici più elevati di big ET-1 caratterizzano i pazienti con progressione di malattia.
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Abstract
Despite an apparent long life in vivo, chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells die rapidly in vitro under culture condition. This observation suggests that the apoptotic resistance is not intrinsic to leukemia B cells but that extrinsic factors are necessary for the prolonged survival of CLL cells. In tissue microenvironments, CLL cells interact with different accessory cells that provide signals for survival, proliferation and drug-resistance. The endothelin axis, comprising endothelins (ET-1, ET-2 and ET-3) and their receptors (ETAR and ETBR), has recently emerged as relevant player in tumor growth and metastasis by regulating mitogenesis, cell survival, angiogenesis, tumor-infiltrating immune cells and invasion.
The aim of this study was to investigate whether ET-1/ETAR signaling pathway is involved in CLL cells and endothelial cells crosstalk and represent a novel pathway involved in CLL maintenance and progression.
Purified CLL cells cultured in vitro in direct contact with endothelial cells experienced a reduction of spontaneous and drug-induced apoptosis as well as a significant transcriptional modification. Recently, we have demonstrated by GEP analysis that one of the most up-regulated genes in CLL cells after co-culture on endothelial cell layers is ET-1, whose up-regulation was confirmed also by RT-PCR (n=30, p<0.05). Moreover, we found a huge increase in ET-1 secretion from 0.6±0.1 pg/mL in CLL alone to 51.6±0.5 pg/mL in co-cultured system (n=26, p<0.05) in conditioned media. CLL cells circulating in peripheral blood and infiltrating tissues secreted ET-1 and expressed the receptor type A (ETAR) at high level on the cellular surface compare to normal controls, indicating that ET-1/ETAR axis could be a peculiar mechanism of leukemic cells. Moreover, CLL cells cultured alone with the addition of recombinant ET-1 peptide up to 100nM experienced an increase in survival relative to control (p<0.05). In contrast, the blockage of ETAR throughout BQ123 selective antagonist abrogated the ET-1 mediated apoptosis resistance. The stimulation of CLL cells with ET-1 induced the activation of PI3K/AKT and ERK/MAPK signaling pathways and increase the metabolic activation of the cells as measured by MTT assay (n=10, FC=1.25 compared to unstimulated control, p=0.018). Consistently, BQ123 inhibited ET-1-mediated Akt and Erk phosphorylation and was able to abrogate ET-1-mediated CLL activation. Moreover, the direct contact between CLL cells, labeled or not with CFSE, and endothelial layer increased the number of divided cells, effect that was significantly reduced pretreating cells with BQ123 (p=0.003).
Furthermore, we measured ET-1 precursor (big ET-1 peptide) levels in plasma samples collected from a multicentric cohort of CLL patients (n=101) by ELISA method. Higher levels of big ET-1 were detected in patients with advanced Binet stage (p=0.004), high β2 microglobulin (p<0.0001), unmutated IGHV status (p=0.003), and intermediate/high FISH risk (p=0.002). Patients with higher levels of big ET-1 (≥5.4 pg/mL) showed shorter time to first treatment (TTFT), as compared to CLL with low big ET-1 levels (median TTFT, 88 vs. 155 months, p=0.005). Moreover, variations of big ET-1 plasma levels between serial plasma samples were measured in patients experiencing disease progression.
Collectively, our data describe for the first time a role of ET-1/ETAR signaling in CLL prolonged survival and in CLL interaction with endothelial cells suggesting that ET-1 may contribute to establish a nursing and protective niche in infiltrated tissues. Moreover, ET-1 mediates activation and proliferative signals in CLL cell that can be blocked by selective inhibition of ETAR. In vivo, higher plasma levels of big ET-1 characterize patients with progressive disease.
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