Riassunto analitico
Tra le neoplasie mieloproliferative Philadelphia negative, la mielofibrosi primaria (PMF) è il disordine più aggressivo. E’ caratterizzata da fibrosi del midollo osseo (BM), emopoiesi extramidollare, mobilizzazione dei progenitori emopoietici e mieloproliferazione, a carico sia del lineage granulocitario che megacariocitario (MK). Nonostante la PMF sia un’entità clinica nota dal 1951, solamente nel 2005 sono state gettate le basi per la comprensione dei meccanismi molecolari alla base di questa patologia, con la scoperta della mutazione JAK2V617F, presente nel 60-70% dei pazienti affetti da PMF. Da allora, sono state scoperte altre mutazioni, come sui geni MPL, CALR, ASXL1, DNMT3A. Nonostante ciò, manca ancora un quadro definito dei meccanismi patogenetici alla base della PMF. Recentemente, sono stati identificati ulteriori meccanismi molecolari: l’espressione aberrante di microRNAs (miRNAs) sembra avere un ruolo importante poiché sono state riportate signatures di miRNA che discriminano cellule di PMF dalle normali. Per studiare la deregolazione dei miRNA nella PMF, ne abbiamo ottenuto il profilo di espressione da cellule CD34+ provenienti da 31 donatori sani (16 da sangue periferico e 15 da BM) e 42 pazienti affetti da PMF, utilizzando l’array Affimetrix miRNA 2.0. Tra i miRNA modulati, ve ne sono diversi già descritti nell’emopoiesi normale o maligna; in particolare, tra i miRNA up-regolati più interessanti, vi è miR-21-5p è up-regolato nelle cellule CD34+ di PMF e il modello murino di overespressione midollare sviluppa linfomi. Dal momento che i miRNAs agiscono indirettamente nei processi biologici bersagliando mRNAs, abbiamo eseguito un’analisi integrata (IA) con il profilo di espressione genica, ottenuto nel nostro laboratorio dalla stessa popolazione cellulare. L’IA è stata eseguita con il software Ingenuity Pathway Analysis, in grado di combinare i target predetti in silico con i dati di espressione. Abbiamo così identificato circuiti coinvolti nella disregolazione della trascrizione e del rimodellamento della cromatina, processi correlati all’insorgenza e progressione della PMF. In particolare, abbiamo identificato un network che riunisce diversi oncomiRs (miR-155-5p, miR-19a-3p, miR-29a-3p) che bersagliano geni la cui down-regolazione è stata associata all’emopoiesi maligna (JARID2, NR4A3, CDC42, HMGB3). I dati ottenuti dai saggi di luciferasi 3’UTR hanno confermato un alto potere predittivo dell’IA, provato dalle 11/18 predizioni corrette presenti nel network in esame. Inoltre, poichè la down-regolazione di JARID2 era stata precedentemente associata ad un aumentato differenziamento MK, abbiamo qui dimostrato che l'upregolazione di miR-155-5p promuove un'espansione della linea MK, targettando JARID2. Inoltre, il miRNA up-regolato miR-494 ha suscitato il nostro interesse, poiché bersaglia svariati mRNA down-regolati, la cui diminuita espressione gioca un ruolo importante in varie neoplasie mieloidi. Al fine di studiare il ruolo di miR-494 nella patogenesi della PMF, abbiamo over-espresso questo miRNA in cellule CD34+ normali. La valutazione del ciclo cellulare ha evidenziato un aumento di cellule in fase G0/G1, mentre lo studio del differenziamento ha evidenziato che l’up-regolazione di miR-494 è in grado di forzare il commitment verso la linea MK, coerentemente con il tratto distintivo della PMF di una abnorme proliferazione di questa popolazione. Nel complesso, l’integrazione dei profili di espressione di geni e miRNA ha permesso di identificare network nei quali interagiscono miRNA e geni deregolati, chiarendo alcune caratteristiche patogenetiche della PMF. Infine, l’IA si è dimostrata un approccio biologicamente rilevante per identificare miRNA espressi in modo differenziale, come miR-494, la cui overespressione è potenzialmente coinvolta nella megacariocitopoiesi aberrante.
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Abstract
Primary myelofibrosis (PMF) is the most aggressive disorder among Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasms. It is characterized by bone marrow (BM) fibrosis, extramedullary haematopoiesis, and myeloproliferation, involving both megakaryocitic (MK) and granulocytic lineages. Despite PMF is well-known clinical entity initially described in 1951, the first insight into the molecular mechanisms underlying this neoplasm was gained only in 2005 with the discovery of somatic gain-of-function mutation JAK2V617F, shared by 60% of PMF patients. Since then, many other mutations were found, such as in MPL, CALR, ASXL1, DNMT3A genes. Nonetheless, a complete framework of the leading pathogenetic mechanisms is still far from being defined. Recently, new molecular mechanisms were uncovered. Among them, aberrant microRNA (miRNA) expression seems to add to the molecular complexity of PMF, as specific miRNA signatures capable of discriminating PMF cells from those of normal donors were previously reported. To have a comprehensive picture of miRNA deregulation in PMF, we profiled miRNA expression in CD34+ cell samples from 31 healthy donors (16 from peripheral blood and 15 from BM) and 42 PMF patients, by means of Affymetrix arrays. Among the miRNAs modulated in PMF, several miRNAs were already described as implicated in normal or malignant hematopoiesis; in particular, among upregulated miRNAs, we found miR-29a-3p, whose overexpression is related to the onset of leukaemia in mice; similarly, miR-21-5p is upregulated in PMF CD34+ cells and a miR-21-5p-overexpressing mouse model develops lymphomas. Moreover, since miRNAs act indirectly in biological processes by targeting mRNAs, we performed an integrative analysis (IA) with the gene expression profile obtained in our lab from the same CD34+ cell population. IA was performed in silico by means of Ingenuity Pathway analysis software, which is able to combine computational predicted targets with gene expression data. Thus, we identified different networks involved in the dysregulation of transcriptional control and chromatin remodeling, potentially related to PMF onset and progression. In particular, we uncovered a circuit gathering several oncomiRs (miR-155-5p, miR-19a-3p, miR-29a-3p) targeting genes whose downregulation has been associated to malignant hematopoiesis (JARID2, NR4A3, CDC42, HMGB3). The data obtained from 3'UTR luciferase assays pointed out a high predictive power of IA, as proved by 11/18 successful predictions for the above-mentioned network. Since JARID2 down-regulation was previously associated with an increased MK commitment, we further demonstrated that upregulated miR-155-5p targets JARID2 in CD34+ cells, thus promoting an expansion of the MK lineage cells. Moreover, upregulated miR-494-3p drew our attention, since it targets the highest number of anti-correlated mRNAs, downregulated in PMF CD34+ cells. In order to investigate the role of miR-494-3p in PMF pathogenesis, we decided to overexpress this miRNA in normal CD34+ cells. Assessment of cell cycle variations highlighted an increase in G0/G1 phase cells, whereas evaluation of cell differentiation unveiled that miR-494-3p enforced expression was able to skew the haematopoietic commitment towards the MK lineage, consistently with the distinctive feature of PMF of an abnormally increased MK population. As a whole, integration of gene and miRNA expression profiles uncovered regulatory networks in which aberrantly expressed miRNAs and genes interact, elucidating some of the pathogenetic characteristics of PMF. Finally, IA was demonstrated a biologically relevant approach to identify aberrantly expressed miRNAs crucial to PMF pathogenesis, such as miR-494-3p and miR-155-5p, whose overexpressions are potentially involved in the abnormal megakaryopoiesis.
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