Riassunto analitico
Il fattore di trascrizione NF-Y è composto da tre subunità altamente conservate, NF-YA, NF-YB e NF-YC, tutte necessarie per il legame sequenza-specifico al DNA. NF-Y ha un ruolo fondamentale nella regolazione della progressione del ciclo cellulare, controllando in particolare la trascrizione dei geni G2/M, ma anche di geni associati alla replicazione e al riparo del DNA.
Numerosi risultati evidenziano che NF-Y è coinvolto nella trasformazione tumorale. Sebbene nei tumori non siano mai state identificate specifiche mutazioni nelle subunità di NF-Y, l’esame sistematico dei profili d’espressione proteica indica che NF-YA aumenta in diversi tipi di cancro. Inoltre, l’analisi bioinformatica dei meccanismi regolativi perturbati nei tumori ha individuato in NF-Y uno dei fattori trascrizionali responsabili delle modificazioni che portano a trasformazione neoplastica.
L’aumento dei livelli d’espressione del gene regolato da NF-Y Topoisomerasi-IIα (TOP2A) è stato riscontrato in diverse cellule tumorali. L’enzima TOP2A svolge un ruolo fondamentale nel metabolismo del DNA e nell’organizzazione della cromatina. Questo enzima è il bersaglio di molti farmaci anti-tumorali di successo, come i cosiddetti “veleni della TOP2A”, che intrappolano i complessi TOP2A-DNA e creano rotture del doppio filamento di DNA (DSB), portando a morte cellulare. In questo lavoro mostriamo che il curcuminoide bis-DemetossiCurcumina (bDMC) induce DSB irreversibili e morte cellulare apoptotica selettivamente nelle cellule tumorali, bersagliando l'attività e l’espressione della TOP2A. Una breve esposizione a bDMC blocca i complessi TOP2A-DNA, inibendo l'attività decatenante dell’enzima, mentre l'esposizione prolungata reprime la trascrizione della TOP2A, riducendo il legame di NF-Y sul suo promotore ed alterando così la sua conformazione cromatinica. Infatti, bDMC compromette chiaramente l’espressione e la localizzazione sub-cellulare delle subunità di NF-Y. I nostri risultati suggeriscono che la duplice attività di bDMC su TOP2A rappresenta una nuova strategia terapeutica per indurre apoptosi persistente nelle cellule tumorali ed individuano la modulazione di NF-Y come un approccio promettente nella terapia anti-cancro.
Con l'obiettivo di poter sviluppare una terapia diretta contro NF-Y, abbiamo studiato i meccanismi molecolari che controllano l'espressione delle subunità di NF-Y in cellule tumorali. I nostri studi evidenziano un complesso processo di autoregolazione che controlla la corretta espressione NF-Y, sia a livello di trascrizione genica che di stabilizzazione proteica mediante interazioni proteina-proteina.
Infine, considerando che i livelli nucleari di NF-YA aumentano all'inizio della fase di Sintesi e che la sua inattivazione altera la progressione delle cellule attraverso la fase S, abbiamo studiato il ruolo di NF-Y nella replicazione del DNA. Trascrizione e replicazione del DNA sono processi fondamentali che devono essere regolati accuratamente per mantenere l'integrità del genoma ed è sempre più evidente che i fattori trascrizionali possono essere coinvolti nella regolazione della replicazione del DNA. Grazie al sistema di Xenopus laevis e a metodiche in vitro, abbiamo potuto studiare la replicazione del DNA in assenza di trascrizione, scoprendo un ruolo non-trascrizionale di NF-Y nella replicazione del DNA. In cellule umane, il silenziamento genico di NF-YA conferma che NF-Y è coinvolto nella replicazione del DNA e ulteriori studi potranno caratterizzare meglio quali sono i meccanismi molecolari alla base di questa attività.
Complessivamente, i nostri risultati evidenziano che NF-Y ha un ruolo a livello sia trascrizionale che non trascrizionale nel controllo della proliferazione cellulare, facendo di NF-Y un bersaglio ancora più interessante per lo sviluppo di nuove terapie anti-proliferative contro le cellule tumorali.
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Abstract
The transcription factor NF-Y is a heterotrimeric complex composed by three highly conserved subunits, NF-YA, NF-YB and NF-YC, all necessary for sequence-specific DNA binding. NF-Y is a fundamental regulator of cell proliferation and cell cycle progression, controlling particularly the transcription of G2/M genes, but also genes associated to DNA replication and repair.
Numerous findings highlight that NF-Y is involved in cancer. Although mutations in NF-Y subunits have never been specifically identified in tumours, systematic examination of protein expression profiles indicates that NF-YA is upregulated in different types of cancer. In addition, the analysis of global regulatory perturbations across human cancers pointed at NF-Y as one of the transcription factors responsible for oncogenic transcriptional changes.
Increased levels of the NF-Y-target gene Topoisomerase-IIα (TOP2A) have been identified in various cancer cells. TOP2A enzyme plays a fundamental role in DNA metabolism and chromatin organization. It is the target of many successful anti-cancer drugs, such as TOP2A poisons which stabilize TOP2A-DNA cleavage complexes and create DNA double strand breaks (DSBs), leading to cell death. Here we show that the Curcumin-derivative bis-DemethoxyCurcumin (bDMC) irreversibly induces DSBs and apoptotic cell death selectively in cancer cells by targeting TOP2A activity and expression. Short-term exposure to bDMC induces retention of TOP2A-DNA intermediates, impairing TOP2A decatenating activity, while longer exposure inhibits TOP2A transcription by reducing the recruitment of NF-Y on its promoter, thus altering its chromatin status. Indeed, bDMC clearly impairs expression and sub-cellular localization of NF-Y subunits. Our findings suggest that the dual activity of bDMC on TOP2A represents a novel therapeutic strategy to induce persistent apoptosis in cancer cells and identify NF-Y regulation as a promising approach in anti-cancer therapy.
With the aim of developing NF-Y-targeted therapy, we investigated the molecular mechanisms controlling NF-Y subunits expression in cancer. Our studies highlight a complex autoregulatory loop which controls proper NF-Y expression, both at the level of gene transcription and of protein stabilization via protein-protein interactions.
Finally, taking into account that NF-YA nuclear levels increase at the onset of S phase and its inactivation affects the progression of cells through S phase, we investigated the role of NF-Y in DNA replication. Transcription and DNA replication are fundamental DNA metabolic processes that need to be finely regulated to preserve genome integrity and accumulating evidences suggest the involvement of transcription factors in the regulation of DNA replication. We exploited the Xenopus laevis cell-free system to study cell-cycle regulated DNA replication in the absence of transcription, unravelling a novel non-transcriptional role of NF-Y in DNA replication. In human cells, silencing of NF-YA confirms that NF-Y is involved in DNA replication and further studies will better characterize which are the underlying molecular mechanisms.
All together, our results highlight that NF-Y plays both a transcriptional and non-transcriptional role in controlling cell proliferation, making of NF-Y an even more attractive target for the development of anti-proliferative therapy in cancer cells.
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