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I microRNA (miRNA) sono una famiglia di piccoli RNA non codificanti (19-25 nucleotidi) che regolano negativamente l'espressione genica a livello post-trascrizionale.
I miRNA agiscono in numerosi processi cellulari come lo sviluppo, la proliferazione, l’ apoptosi, il differenziamento e la cancerogenesi.
Studi recenti hanno dimostrato un ruolo essenziale dei miRNAs anche nell’emopoiesi normale e patologica.
L’emopoiesi è un processo gerarchico finemente controllato da complessi eventi molecolari che regolano la proliferazione, il differenziamento e l’apoptosi delle cellule staminali ematopoietiche (HSC). L'attivazione di diversi programmi di differenziamento avviene mediante l’attivazione o l’inibizione di network di fattori trascrizione.
Fattori di trascrizione (TF) e miRNA collaborano strettamente nella regolazione dell'espressione genica durante il differenziamento emopoietico: i TF regolano l'espressione dei geni dei miRNA, e allo stesso tempo i miRNA hanno come target i TF.
Un’alterata espressione dei miRNA può portare all’insorgenza di disordini ematopoietici come la leucemia mieloide acuta (AML).
In un recente studio (Lutherborrow et al., 2010) è stata analizzata l'espressione genica dei miRNA in pazienti affetti da Leucemia Mieloide Acuta (AML), con particolare attenzione ai miRNA differenzialmente espressi nei sottotipi FAB M1 e M5. Il risultato di tale comparazione ha evidenziato l’overespresione dei miR-146ab, miR-181abd, miR-130a, miR-663, miR-135b.
I target dei miRNA indicati, in particolare del miRNA130a, risultano essere Klf4, MafB, IRF8 e HoxA10, master regulators del differenziamento monocitario.
Si è ipotizzato che i miRNA sopra elencati potessero essere coinvolti nel blocco differenziativo dei blasti M1.
Lo scopo di questo lavoro riguarda lo studio di funzione del miR-130a nel differenziamento emopoietico, al fine di chiarirne il ruolo nella monocitopoiesi.
Inizialmente è stato valutato il livello di espressione del miR-130a nella mielopoiesi (HSC, mieloblasti, monoblasti, granulociti e monociti) e nelle HSC stimolate con vitamina D3. I dati ottenuti mostrano una down-regolazione del miRNA-130a nel differenziamento monocitario.
Sono stati condotti studi di gain- and loss-of-function, attraverso trasfezione di molecole mimanti (pre-miR) o inibenti (anti-miR) in cellule CD34+. La capacità differenziativa delle cellule trattate è stata analizzata attraverso qRT-PCR, Western blot, saggi immunofenotipici e funzionali.
I campioni overesprimenti il miR-130a mostrano un chiaro rallentamento del differenziamento monocitario, documentato dal risultato ottenuto nel CFU assay che mostra un aumento delle CFU-GM e una diminuzione delle CFU-M, dato cofermato dall’analisi dell’espressione genica dei marker differenziativi monocitari (CD14, CD163 and MRC1), delle citochine infiammatorie (IL-1, IL-6, IL-8, IL10RB, CCL2 e TNFa) e dal fattore di trascrizione CEBPβ, infatti tutti risultano essere down-regolati.
Per confermare i dati ottenuti, sono stati effettuati le stesse analisi in campioni di CD34+ trasfettati con anti-miR130a; come atteso i risultati hanno mostrato un aumento del differenziamento monocitario.
Questo studio evidenzia il ruolo del miR-130a nella modulazione della monocitopoiesi, confermando che l’overespressione del miRNA perturba il normale differenziamento, contribuendo al blocco differenziativo caratterizzante le AML M1.
Questi dati suggeriscono l’utilizzo di una strategia antimiR in grado di ristabilire un corretto profilo d'espressione genica, permettendo il normale differenziamento dei progenitori mieloidi.
A tal fine, abbiamo deciso di utilizzare acidi peptido-nucleici (PNA) per regolare l’espressione del miR-130a. I risultati preliminari mostrano un aumento del differenziamento monocitario nelle CD34+ e nelle linee cellulari di AML.

MicroRNAs (miRNA) are a small noncoding family of 19- to 25-nt RNAs that regulate gene expression by targeting mRNAs in a sequence specific manner. Currently, about 1500 different human miRNAs are listed in the miRBase registry. They are involved in the regulation of gene expression during development, cell proliferation, apoptosis and cancer. Recent studies demonstrate a significant role of miRNAs also in normal and malignant hematopoiesis. Hematopoiesis is a highly regulated process controlled by complex molecular events that simultaneously regulate commitment, differentiation, proliferation, and apoptosis of hematopoietic stem cells (HSC). The activation or inhibition of a network of transcription factors (TFs) is required to initiate the commitment of HSC to different lineages precursors. TFs and miRNAs act in concert to regulate gene expression during hematopoietic differentiation: TFs regulate the expression of miRNA genes, whereas TFs are miRNA targets. miRNA misexpression may contribute to the development of hematopoietic malignancies such as acute myeloid leukemia (AML). In a recent study (Lutherborrow et al., 2010), a microRNA expression analysis has been performed in AML samples, focusing on the differentially expressed microRNAs between M1 and M5 subtypes. The results of this comparison highlighted that miR-146ab, miR-181abd, miR-130a, miR-663 and mir-135b are overexpressed in M1 samples. Interestingly, the targets of these miRNAs are key transcription factors involved in monocyte/macrophage differentiation, i.e. KLF4, MAFB, HOXA10 and IRF8. The aim of this study is to analyse the role of miRNA-130a that is upregulated in AML and probably involved in the differentiation block characterizing myelogenous leukemia. The expression profile of miR-130a was evaluated in myeloid differentiation (HSCs, myeloblasts, monoblasts, granulocytes and monocytes) and in HSCs cells stimulated with Vitamin D3. The data obtained show a miR-130a gene expression reduction in monocitopoyesis. In order to investigate the functional role of miR-130a, we have performed gain- and loss-of-function experiments (by means of transfection of pre-Mir or anti-miR molecules) in CD34+ cells. The differentiation capacity of treated cells was monitored by qRT-PCR, Western blot, immuno-phenotypic and functional assays. The samples transfected with pre-miR-130 shown a slowdown of monocyte differentiation, documented by CFU assay, which shows a significant higher percentage of colonies CFU-GM and a significant smaller percentage of colonies CFU-M, and confirmed by gene expression analysis of differentiation markers (CD14, CD163 and MRC1), inflammatory cytokines (IL-1, IL-6, IL-8, IL10RB, CCL2 e TNFa) and transcription factors (CEBPβ) involved in the monocyte/macrophage differentiation that result all down regulated. We have performed the same monocyte differentiation analysis in CD34+ cells transfected with anti-miR-130a; accordingly with what expected, in this case the data obtained show an increase of monocyte differentiation. This study highlights the role of miR-130a in the modulation of monocyte differentiation and confirmed the hypothesis that its overexpression can contribute to the differentiation block of AML M1. These data suggest the use of antimiR strategy to restore a correct gene expression, in order to allow the normal differentiation of myeloid progenitors. For this reason, we have decided to use peptide nucleic acids (PNA) as an approach to silence the expression of miR-130a. Preliminary results has shown an increase of monocyte differentiation in CD34+ sample and in AML cell lines.