• ,,,, Tristetraprolina
• EMT
• MACC1
• SOX9
• ZEB1

Tristetraprolina (TTP) è una proteina la cui funzione è quella di legare sequenze ricche in Adenina e Uracile (chiamate sequenze ARE) nel 3’ non-tradotto (3’UTR) di molti trascritti e di inibirne l’espressione. TTP e altri membri della stessa famiglia esercitano un ruolo fondamentale nel regolare l’espressione di molti geni proinfiammatori o oncogeni e, infatti, la perdita della loro funzione può contribuire alla trasformazione tumorale in molti contesti diversi, fra cui il cancro colorettale (CRC).
Evidenze sperimentali riportano una progressiva perdita di espressione di TTP ed una concomitante induzione dei suoi geni target a partire dai primi stadi di tumorigenesi, tuttavia poco si conosce del suo ruolo in questo processo. Il nostro scopo è stato quindi quello di approfondire il ruolo di questa proteina nella biologia della mucosa colo-rettale e nel suo processo di trasformazione tumorale. A tal fine abbiamo identificato tre nuovi bersagli putativi di TTP che risultano essere coinvolti in questo processo: MACC1, ZEB1 e SOX9. Questi geni mostrano un’attività oncogenica e sono coinvolti nel processo di transizione epitelio-mesenchimale (EMT), anche se in maniera diversa. Al fine di validarli come bersagli di TTP abbiamo svolto esperimenti di over-espressione che hanno mostrato come, in presenza di TTP, vengano fortemente inibiti sia a livello trascrizionale che proteico. Inoltre abbiamo svolto saggi funzionali dove la presenza del 3’UTR di questi geni risulta sufficiente per diminuire l’attività dell'enzima Luciferasi quando TTP viene over-espresso, confermando l'osservazione precedente.
Successivamente abbiamo analizzato gli effetti di TTP sull’EMT. Coerentemente con il ruolo dei suoi geni target abbiamo potuto osservare come questa proteina causi l’aumento dei marcatori epiteliali E-Caderina e ZO-1(Zona Occludens 1) e la concomitante diminuzione dei marcatori mesenchimali Vimentina e N-caderina. Esperimenti di immunofluorescenza hanno rivelato che E-caderina non è solo più espressa, ma è maggiormente concentrata nelle giunzioni cellulari. L' over-espressione di TTP conferisce inoltre una maggiore impedenza al monostrato cellulare, una caratteristica tipica delle cellule epiteliali.
Alla luce di questi dati ci siamo chiesti se queste modificazioni fenotipiche influiscano sul comportamento cellulare e in particolare sui processi coinvolti nell’EMT. Abbiamo quindi analizzato la migrazione cellulare ma, sorprendentemente, non abbiamo registrato nessuna differenza significativa sia attraverso saggi tradizionali che basati sull’impedenza. In secondo luogo ci siamo focalizzati sulla capacità di crescita in assenza di ancoraggio. Saggi di soft-agar hanno evidenziato come la presenza di TTP diminuisca il numero e la dimensione delle colonie ottenute coltivando le cellule in un terreno semisolido. Inoltre abbiamo analizzato la vitalità cellulare in condizioni di crescita in assenza di adesione e abbiamo verificato come questa proteina renda le cellule più sensibili all’anoikis.
Infine abbiamo indagato la relazione fra TTP e la via di segnalazione molecolare mediata da Wnt. I risultati ottenuti mostrano come l' inibizione di questa via di segnale attraverso un composto chimico induca l’espressione di TTP in maniera tempo-dipendente e ,al contrario, come il trattamento delle linee cellulari con Wnt3a ne reprima l’espressione sia a livello proteico che di mRNA.
Questi dati indicano che il silenziamento di TTP osservato nel CRC determina un'alterazione dell’espressione dei suoi geni target coinvolti nell’EMT. Inoltre suggeriscono che questo fenomeno possa essere correlato con l’attivazione costitutiva della via di segnalazione di Wnt che è di fondamentale importanza nella patogenesi del CRC.

Tristetraprolin (TTP) is a RNA binding protein that recognizes AU-rich sequences (AREII) in the 3’ untranslated region (3’UTR) of specific transcripts and thereby inhibits their expression. TTP and the other members of its family exert a fundamental role in limiting the expression of pro-inflammatory and pro-proliferative genes. Impairment of their function can indeed lead to neoplastic transformation as observed in a variety of cancerous malignancies, including colorectal cancer. Experimental evidence shows a progressive down-regulation of TTP (in vivo) starting from the early stages of tumour development, together with concomitant up-regulation of some of its target genes. Nevertheless, its role in the development of cancer hasn't been fully elucidated. Our aim is to identify new targets of TTP and to further characterize its biological role in colon physiology and colorectal carcinogenesis. Taking advantage of a database of ARE-containing genes we selected three putative TTP target genes having an overt role in colon tumorigenesis: MACC1, ZEB1 and SOX9. These genes display oncogenic activity and a positive correlation with epithelial-to-mesenchimal transition (EMT). In order to validate these genes as new TTP targets, we performed TTP over-expression in CRC cell lines which resulted in a significant decrease of their mRNA and protein levels. These data were confirmed through luciferase reporter assays where the presence of the 3’UTRs of these genes' mRNA strongly decreased luciferase activity after TTP over-expression. Subsequently we analysed the effect of TTP on EMT. Consistently with the role of its target genes we observed that TTP overexpression upregulates the epithelial markers E-Cadherin and ZO-1(Zona Occludens 1) and determines in parallel a reduction of the mesenchymal markers Vimentin and N-cadherin. Moreover, we observed that TTP-overexpressing cells show a higher impedance of the cellular monolayer consistent with a more epithelial phenotype. These findings were confirmed by immuno-fluorescence stainings showing how e-cadherin is not only expressed at higher levels, but it's also more concentrated in the cellular junctions compared to controls. Successively, we asked whether this modification of the cellular phenotype could affect cells' behavior and EMT-related processes. Therefore, we analyzed the migratory ability of cells but, surprisingly, we could not detect any significant difference between control and TTP overexpressing cells in both traditional and impedance-based scratch assays. Since another feature of EMT is the loss of intercellular contacts and the ability to grow in the absence of substratum, we checked cellular anchorage-independent growth. Soft-agar assays showed that TTP inhibits the proliferation of cells cultured in semi-solid medium resulting in a reduction in number and size of colonies. Moreover, we observed by specific assays that TTP overexpressing cells have a higher susceptibility to anoikis compared to the control populations. Eventually, we examined the relation between TTP and the Wnt pathway. Interestingly, we found that silencing of TCF4, a transcriptional effector of b-catenin, increases the expression of TTP in a time dependent-manner and, conversely, the treatment with a Wnt3a-conditioned medium, lowers its expression both at protein and mRNA levels. Overall, our data show that the down-regulation of TTP observed in colorectal cancer alters the expression of oncogenic target genes involved in EMT, thereby weighing upon the pathological phenotype of cells. Moreover, we observed that TTP downregulation might be related to the constitutive activation of Wnt pathway which is a milestone of colon cancer.