Riassunto analitico
L’assenza della Laminina 332 causa nell'uomo la forma giunzionale di Epidermolisi Bollosa (EB- LAM332), una devastante malattia genetica della pelle caratterizzata dalla formazione di bolle a livello della lamina lucida della membrana basale e dall'assenza di emidesmosomi. L'EB Laminina 332-dipendente è anche caratterizzata da una perdita progressiva del numero di cellule staminali epidermiche in vivo, che rappresenta uno step limitante a possibili approcci di terapia genica ex vivo. Abbiamo osservato che la riduzione del potenziale clonogenico dei cheratinociti primari derivati da pazienti con EB-LAM332 è associata all'alterazione del pathway di YAP/TAZ. L'espressione di YAP/TAZ e della survivina che è un loro noto target, è fortemente diminuita nei cheratinociti di EB-LAM332 che non contengono YAP nucleare, ma solo YAP fosforilato, inattivo e citoplasmatico. Il potenziale proliferativo di tali colonie è fortemente compromesso e le colture di cheratinociti primari ottenuti da biopsie di pazienti con Epidermolisi Bollosa Giunzionale vanno incontro rapidamente a senescenza replicativa, in seguito a una deplezione di olocloni causata dall'apoptosi. Questo scenario non si osserva negli altri tipi di epidermolisi bollosa, come l'epidermolisi bollosa distrofica collagene VII dipendente o l'epidermolisi bollosa giunzionale collagene XVII dipendente, ma è ricapitolata dalla down-regolazione attarverso i siRNA della catena β3 della laminina 332. Al contrario, le cellule clonogeniche primarie ottenute da biopsie di donatori sani esprimono livelli variabili di YAP/TAZ nucleare. La quantità di YAP/TAZ nucleare è elevata nelle cellule staminali dell'epidermide, identificate come olocloni, e diminuita o assente nei merocloni e paracloni, che hanno proprietà di “transient amplifying progenitors”. In particolare, YAP è nucleare negli olocloni mentre nei merocloni e paracloni è inattivo e fosforilato. La terapia genica ex vivo di EB-LAM332 mediante vettori retrovirali, ripristina il potenziale proliferativo e clonogenico e le propietà di adesione dei cheratinociti primari di EB-LAM332, portando alla rigenerazione completa degli emidesmosomi in vivo. Il ripristino delle proprietà proliferative e di adesione dei cheratinociti di EB-LAM332 è accompagnato dall'espressione di normali livelli nucleari di YAP/TAZ e della survivina. La down-regolazione di YAP/TAZ nei cheratinociti primari compromette la proliferazione e induce apoptosi; al contratio, l'overespressione della forma costitutivamente attiva di YAP induce una senescenza replicativa prematura dei cheratinociti. Questi dati suggeriscono che la via di segnalazione mediata da YAP/TAZ potrebbe giocare un ruolo fondamentale nel mantenimento del potenziale clonogenico e proliferativo delle cellule staminali epidermiche attraverso la laminina 332 che è una proteina di adesione tra la cellula e la matrice extra-cellulare. Inoltre, i dati ottenuti hanno importanti implicazioni per una terapia genica efficiente ex vivo dell'Epidermolisi Bollosa Giunzionale.
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Abstract
Loss of laminin-332 (Lam332) causes Junctional Epidermolysis Bullosa (JEB), a devastating genetic skin adhesion disorder characterized by blister formation at the level of the lamina lucida of the basement membrane and absence of hemidesmosomes. Laminin332-dependent JEB is also characterized by a depletion of the epidermal stem cell pool, which renders ex vivo gene therapy cumbersome. We report that reduction of clonogenic potential of primary JEB keratinocytes is associated to perturbation of the YAP/TAZ signalling pathway. The expression of YAP/TAZ and its well known target Survivin is significantly decreased in Lam332-JEB keratinocytes, which do not contain nuclear YAP but only phosphorylated, inactive, cytoplasmic YAP. The proliferative potential of Lam332-JEB colonies is strongly impaired and Lam332-JEB cultures rapidly undergo replicative senescence, due to apoptosis-dependent depletion of holoclones. This scenario is not observed in other types of EB, such as collagen VII-dependent dystrophic EB or collagen XVII-dependent JEB, but is recapitulated by siRNA-mediated down-regulation of the β3 chain of Lam332. In contrast, primary clonogenic cells obtained from normal human biopsies express variable levels of nuclear YAP/TAZ. The expression level of YAP/TAZ is high in cultured epidermal stem cells, detected as holoclones, and decreased or absent in meroclones and paraclones, which have properties of transient amplifying progenitors. Of note, nuclear YAP is found exclusively in holoclones, whilst meroclones and paraclones contain phosphorylated, inactive YAP. Ex vivo retroviral-mediated gene therapy of laminin-332-dependent JEB, rescues the clonogenic and proliferative potential and the adhesion properties of primary JEB keratinocytes, leading to full hemidesmosome restoration in vivo. Such restoration of proliferative and adhesion properties in JEB keratinocyets is associated to expression of normal nuclear levels of YAP/TAZ and its target Survivin. YAP/TAZ knock-down in primary epidermal cultures hampers proliferation and induces apoptosis; on the opposite, overexpression of constitutively active YAP induces premature keratinocytes replicative senescence. These data suggest that YAP/TAZ signalling pathway might play a main role in maintaining the clonogenic and proliferative potential of self-renewing epidermal stem cells through laminin-332, a cell-extracellular matrix (ECM) adhesion protein. These data have important implications for an efficient ex vivo gene therapy of Junctional Epidermolysis Bullosa.
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