Riassunto analitico
La Retinite Pigmentosa (RP) è una distrofia retinica ereditaria che causa la morte cellulare selettiva dei fotorecettori. La maggior parte dei geni mutati codificano per componenti dei bastoncelli coinvolti nel processo di fototrasduzione o per proteine strutturali dei bastoncelli. Al momento i trattamenti sono limitati a poche forme recessive della malattia. Al fine di sviluppare nuove terapie per una forma dominante di RP, abbiamo caratterizzato diverse linee cellulari: le Y79, cellule di retinoblastoma esprimenti la rodopsina umana (RHO); cloni di cellule 661w in cui abbiamo indotto l’espressione della rodopsina murina mediante modificazione genetica con il fattore di trascrizione Nrl e cloni di cellule HeLa che esprimono stabilmente la RHO wild-type (wt) e mutata. In particolare, queste ultime sono state utilizzate, in collaborazione con il Centro di Medicina Rigenerativa di Modena, per sviluppare un approccio di editing genomico con lo scopo di inattivare un allele mutato dominante della RHO mediante l’uso di enzimi di restrizione artificiali, noti come Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) e RNA-guided endonucleases (RGENs o sistemi CRISPR/Cas9), capaci di tagliare il DNA in un sito specifico del genoma causando l’attivazione del meccanismo di riparo della giunzione delle estremità non omologhe che porta all’inattivazione del gene. Due TALENs e due RGENs sono state disegnate dai nostri collaboratori al fine di bersagliare l’esone 1 della RHO dove mappa la mutazione dominante Pro23His. Tali nucleasi sono state testate in vitro mediante trasfezione in cloni di cellule HeLa esprimenti tale mutazione. L’analisi di immunofluorescenza ha confermato la localizzazione nucleare delle TALENs e una parziale localizzazione nucleare della proteina Cas9. Successivamente, è stato analizzato il taglio della RHO wt e mutata mediante CEL 1 Assay che ha mostrato che nessuna delle nucleasi era in grado di distinguere gli alleli wt dagli alleli mutanti. Inoltre, è stata valutata la percentuale di editing genomico mediante sequenziamento e analisi TIDE. Essendo risultato il sistema CRISPR/Cas9 molto più efficiente delle TALENs nel ridurre l'espressione del gene bersaglio, abbiamo focalizzato i nostri studi su due differenti RGENs e le abbiamo testate non solo singolarmente ma anche in coppia. La tecnica del western blotting ha mostrato una riduzione del 90% della proteina RHO in vitro quando le due RGENs venivano trasfettate in coppia. Sulla base di tali evidenze sperimentali, abbiamo testato queste stesse endonucleasi in topi transgenici esprimenti l’allele della RHO con la mutazione P23H. A tal fine abbiamo iniettato in vivo i sistemi CRISPR/Cas9 mediante elettroporazione, un metodo efficiente per indurre l’espressione di DNA plasmidico in cellule retiniche. Entrambe le RGENs esprimenti la proteina Cas9 sono state clonate in un unico vettore e iniettate sottoretina insieme ad un plasmide esprimente la proteina fluorescente EGFP in topi neonati (Post Natal day 1 or PN1). La co-elettroporazione ha permesso di individuare le cellule trasfettate. Le retine elettroporate sono state raccolte a PN7, le cellule retiniche sono state dissociate e, mediante FACS-sorting, sono state selezionate le cellule EGFP positive, da cui è stato estratto il DNA genomico e l’RNA. Abbiamo osservato che le cellule selezionate esprimevano sia la proteina EGFP che la proteina Cas9 confermando in tal modo che il FACS-sorting è un efficiente metodo per analizzare le cellule esprimenti la endonuclease. Il sequenziamento e l’analisi TIDE hanno mostrato editing genomico in un range del 33% in vivo. Al momento stiamo analizzando i livelli della proteina RHO per confermare l’efficacia del sistema CRISPR/Cas9 anche in vivo.
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Abstract
Retinitis Pigmentosa (RP) is a group of inherited neurodegenerative diseases causing selective cell death of photoreceptors and leading to blindness. Most of the genes affected are specific for the function, structure and metabolism of rods. There is a need for the development of new therapies for this group of diseases because, at the moment, treatments are limited to few recessive forms of the disease. To this purpose we characterized in vitro cell systems to develop new therapies for a dominant form of RP. For the studies in vitro we characterized several cell types: Y79 retinoblastoma cell line expressing human rhodopsin (RHO), clones of 661W cells in which we induced expression of murine Rho by genetic modification with the Nrl transcription factor and stable transfected HeLa clones expressing wild-type (wt) and mutant RHO. These genetically modified cells were deeply characterized for the expression of wild type and mutant RHO. In collaboration with the Center of Regenerative Medicine in Modena, we took advantage of these cell lines to develop a genome editing approach to inactivate a dominant allele of RHO using Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and RNA-guided endonucleases (CRISPR/Cas9). These engineered nucleases create specific double strand break (DSB) at desired locations in the genome and harness the cell’s endogenous mechanisms to repair the induced break by the natural process of Non Homologous end-joining (NHEJ) thus leading to the inactivation the gene. Two TALENs and two gRNAs for CRISPR/Cas9 were designed to target RHO at exon 1 where a dominant mutation (Pro23His) maps. The four nuclease systems were tested in vitro by transfection into HeLa clones expressing P23H RHO. Immunofluorescence analyses confirmed the nuclear localization of TALENs and partial nuclear localization of Cas9. Subsequently, the cut of wild type and mutant RHO was analyzed by CEL1 Assay that defined that none of the nucleases could distinguish between wild type and mutant alleles. Moreover, the percentage of editing was evaluated by sequencing and TIDE analysis and defined that CRISPR/Cas9 had higher efficiency than TALENs. We thus focused our studies on testing two different gRNAs for CRISPR/Cas9 either individually or in pairs. Their efficiency in reducing the expression of RHO was defined at protein level by western blotting that showed that two gRNAs together allowed 90% downregulation of the protein in vitro. During the last year of my PhD, we wanted to obtain the proof-of-concept of genome editing with endonucleases in vivo on transgenic mice expressing the P23H RHO mutation. We delivered the CRISPR/Cas9 in vivo by electroporation, which is an efficient method to express DNA plasmids in retinal cells. We performed subretinal injections of the two gRNAs and Cas9 together with a plasmid expressing EGFP in newborn (postnatal day 1 or PN1) mice. The co-electroporation of the EGFP expressing plasmid allowed tracking of transfected cells. Retinae were harvested at PN7, cells were dissociated and EGFP positive cells were FACS-sorted. Genomic DNA and RNA were extracted from sorted cells. We observed that cells expressing EGFP also expressed Cas9 thus confirming that sorting by EGFP is an effective method to analyze cells expressing the endonuclease. Sequencing and TIDE analysis indicated genome editing in a range of 33% in vivo. At present we are analyzing RHO at the protein level to confirm the efficacy of the CRISPR/Cas9 system in targeting RHO protein in vivo.
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