Riassunto analitico
La timidilato sintasi umana (hTS) è un enzima omodimerico. La funzione di questo enzima è quella di convertire dUMP a dTMP. Considerando il ruolo fondamentale che svolge nella sintesi del DNA e l’elevata espressione in alcune linee cellulari tumorali, questo enzima è da tempo un target per la chemioterapia antitumorale. Purtroppo, i farmaci antitumorali attualmente impiegati hanno come effetto una farmaco-resistenza crociata, per cui risultano inefficaci. Da qui, nasce l’esigenza di sviluppare nuove classi di farmaci con un meccanismo d’azione che sia in grado di inibire l’attività catalitica dell’enzima e, al tempo stesso, di ridurre la sua espressione. Una classe interessante di composti a questo proposito è quella degli inibitori dissociativi, che agiscono a livello dell’interfaccia del target spostando l’equilibrio dell’enzima dalla forma attiva omodimerica a quella inattiva monomerica. In particolare, il mio lavoro di tesi si concentra sullo studio delle serie AIC-A e AIC-C di questa nuova classe di composti. Lo scopo principale sarà quello di studiare l’effetto degli inibitori dissociativi sull’equilibrio monomero-dimero della timidilato sintasi umana. Per verificare l’efficacia di questi composti è stata impiegata una tecnica di spettroscopia di fluorescenza, chiamata trasferimento di energia per risonanza (FRET). Per raggiungere gli obiettivi della tesi mi sono occupata prevalentemente della purificazione di hTS e della coniugazione della proteina purificata con due sonde fluorescenti (fluoresceina-maleimide e tetrametilrodamina-maleimide). Poi, per prima cosa è stata verificata la capacità dissociativa della proteina coniugata a concentrazioni decrescenti della stessa in soluzione; e, conseguentemente è stata testata l’efficacia inibitoria del pannello dei composti a varie concentrazioni al fine di valutare la loro costante di dissociazione. Tutti i risultati derivanti da ogni prova sono stati raccolti e analizzati accuratamente. L’insieme delle esperienze effettuate e delle difficoltà incontrate mi hanno permesso di ottimizzare i protocolli esistenti con lo scopo di rendere le procedure più performanti.
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