Riassunto analitico
INTRODUZIONE:L’epcidina (HAMP) è un peptide secreto dal fegato considerato il principale regolatore del metabolismo del ferro, regolata in risposta a segnali fisiologici e fisiopatologici. Il principale sistema che regola l’epcidina coinvolge le proteine morfogenetiche dell’osso (BMP), i loro recettori/corecettori e diverse proteine ancillari. Le BMP sono in grado di legare i recettori ad attività serin-treonin chinasi di tipo I e II, inducendo la fosforilazione delle proteine intracellulari SMAD1/5/8. Gli SMAD1/5/8 fosforilati legano SMAD4, traslocano al nucleo e modulano la trascrizione di geni bersaglio come l’epcidina. Le principali proteine ancillari coinvolte nella via di trasduzione BMP/SMAD sono HFE e il recettore 2 della transferrina (TfR2). HFE e TfR2 sono implicate nella patologia umana ereditaria, l’emocromatosi, dovuta a un’inappropriata sintesi di epcidina che induce un sovraccarico di ferro con conseguente danno tissutale. Numerose BMP sono in grado di indurre la trascrizione di epcidina in vitro, ma la BMP6 è quella centrale nell’espressione di epcidina in vivo. E’ noto che la via di segnalazione mediata dalle BMP/SMAD agisce principalmente attraverso endocitosi e trasduzione del segnale: in particolare, è dimostrato che l’endocitosi mediata da Clatrina propaga il segnale delle SMAD mentre i Caveosomi innescano la trasduzione del segnale indipendentemente dalle SMAD.OBIETTIVO della tesi è chiarire la via endocitosica coinvolta nella regolazione di epcidina in risposta alla stimolazione fisiologica da parte di BMP6. In secondo luogo, indagare il ruolo delle proteine HFE e TfR2 nella regolazione dell’espressione di epcidina mediata dalla via BMP/SMAD.METODI:Abbiamo utilizzato e caratterizzato linee cellulari di epatoma umano (HepG2, Hep3B e HuH7, quest’ultima caratterizzata da una mutazione della proteina HFE che ne impedisce la corretta espressione in membrana) in termini di espressione di RNA messaggero e di proteine dei geni coinvolti nell’endocitosi (Clatrina (Clt) Epsina2 (Eps2), Dinamina (Dyn) e Caveolina1 (Cav1)) e nel metabolismo del ferro (HAMP, HFE, TFR1, HJV, TFR2). Sono stati utilizzati siRNA per bloccare l’espressione di differenti proteine. In particolare, cellule della linea HepG2 sono state trasfettate con siRNA (contro Clt, Eps2, Dyn e Cav1) e trattate con BMP2 o BMP6 per 1 o 16 ore. RNA e proteine sono stati raccolti e analizzati rispettivamente mediante qPCR (HAMP, ID1 (gene responsivo alle BMP) e ALP1 (gene controllato da Cav1), utilizzando RPL19 come normalizzatore) e western blot (espressione/grado di fosforilazione delle proteine SMAD1/5/8).RISULTATI:Abbiamo evidenziato come dopo silenziamento di Dinamina, la proteina chiave nell’endocitosi, l’espressione di epcidina sia drammaticamente ridotta. Questo dimostra che l’endocitosi è cruciale per l’espressione di epcidina. Il trattamento di cellule HepG2 con BMP2 e BMP6 induce l’espressione dell’mRNA di epcidina nelle cellule di controllo, mentre tale induzione è bloccata a seguito di silenziamento di Caveolina, e mantenuta dopo silenziamento di Clatrina. In particolare, l’espressione costitutiva di epcidina è negativamente influenzata dal silenziamento di CAV. Inotre, il silenziamento di CAV induce una completa riduzione dell’espressione di TfR2; al contrario, dopo silenziamento di Clatrina, l’espressione di TfR2 non risulta compromessa. CONCLUSIONI:i dati ottenuti indicano che la trascrizione di epcidina è controllata dall’endocitosi mediata da Caveolina. I dati dimostrano come il TfR2, uno dei principali geni dell’emocromatosi, segua la via di endocitosi mediata da Cav1 e che la sua espressione sia profondamente influenzata dal blocco di questa via di endocitosi. STUDI FUTURI valideranno i dati ottenuti in vitro nel modello murino privo di Cav1 al fine di studiarne le conseguenze sull’espressione di epcidina in vivo.
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Abstract
Introduction: Hepcidin, a 25-amino acid peptide secreted by the liver and product of the HAMP gene, is considered the "master regulator" of iron metabolism. HAMP is transcriptionally controlled in response to a number of physiologic and pathophysiologic signals. The main regulatory system controlling hepcidin involves the bone morphogenetic proteins (BMP), their receptor/co-receptors and a number of ancillary proteins. BMPs form a signaling complex with type I and type II serine threonine kinase receptors, leading to phosphorylation of intracellular SMAD1, SMAD5, and SMAD8 proteins. P-SMAD1/5/8 proteins form a complex with SMAD4 and translocate to nucleus to modulate transcription of target genes such as HAMP. The main ancillary proteins involved in BMP signaling transduction are HFE and transferrin receptor 2 (TfR2). HFE and TfR2 are linked to a relatively common human hereditary disease of iron metabolism, hemochromatosis, due to inappropriate hepcidin synthesis that causes massive body iron overload and severe organ disease. A number of BMPs are able to induce hepcidin transcription in vitro, but BMP6 is the central BMP involve in HAMP expression in vivo. It is known that BMP/SMAD signaling occurs mainly via two main endocytosis and transduction pathways: Clathrin mediated endocytosis has been shown to propagate SMAD signaling while Caveosomes triggers non-SMAD pathway (eg. MAPK).
Objective of this thesis is to elucidate the endocytosis pathway involved in HAMP regulation in response to its physiologic regulator, i.e. BMP6. Secondly, to investigate the role of hemochromatosis proteins HFE and TfR2 in the BMP/SMAD signaling pathway controlling HAMP transcription.
Material and Methods: Hepatoma cell lines HepG2, Hep3B and HuH7, the latter carrying a defect in HFE that precludes proper trafficking and membrane expression, were used as a model. To this purpose, we first characterized all cell lines in terms of mRNA and protein expression of genes involved in endocytosis (namely, Clathrin (Clt), Epsin2 (Eps2), Dynamin (Dyn) and Caveolin1 (Cav1)) and iron metabolism (namely, HAMP, HFE, TFR1, HJV, TFR2).
Cells were silenced using siRNA technology against discrete trafficking molecules. HepG2 cells were transfected with siRNA for Clt, Eps2, Dyn and Cav1 and cultured for 5 days and then treated with BMP2 or BMP6 for 1hr (1ng/ml.2ng/ml and 25ng/ml) and O/N (1ng/ml and 2ng/ml). RNA and proteins were harvested and analysed by Real time PCR (using RPL19 as reference gene) and W/B respectively. We analyzed the expression of HAMP, ID1 (a BMP responsive gene) and ALP(known to be controlled by CAV) by RT-PCR. The expression as well as phosphorylation of pSMAD 1,5,8, the key signaling proteins in BMP/SMAD signal transduction pathway, was analyzed by W/B under same experimental conditions.
Results: We first showed that after silencing Dynamin, a key protein in endocytosis, HAMP expression was dramatically decreased. This proves endocytosis is crucial for hepcidin expression. Treatment of HepG2 cells with BMP2 and BMP6 induces Hamp mRNA expression in control cells, but fails to do so after Caveolin1 silencing, whereas enhanced HAMP expression is still detected after Clathrin silencing. Upon Caveolin1 silencing, we obtained a complete downregulation of TFR2 expression. On the contrary, upon clathrin silencing, TFR2 expression was maintained. Most notably, constitutive HAMP expression was negatively affected by CAV silencing
Conclusion: The above observations indicate that Hepcidin transcription is controlled through Caveolin mediated endocytosis. The data shows that TfR2, a major hemochromatosis gene, traffic within the CAV endocytic pathway and that its expression, as well as HAMP, is profoundly affected by blocking this endocytic pathway.
The future study is to validate the existing results in the Caveolin1 knock-out mice to study the consequences of hepcidin expression of Caveolin1 deficiency in vivo.
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