Riassunto analitico
La cipolla (Allium cepa L.) è una delle più importanti colture orticole nel mondo e, nonostante la sua importanza, può essere considerata una “coltura orfana” poichè ha ricevuta poca attenzione dai ricercatori rispetto alle altre specie monocotiledoni come riso, mais e grano. La patologia vegetale e le informazioni molecolari utili per il miglioramento degli esistenti programmi di breeding della specie sono in ritardo in confronto alle maggiori colture commerciali, principalmente perchè il genoma della cipolla è troppo complesso da sequenziare o caratterizzare. A. cepa L. (2n=16) è una pianta allogama biennale, con un grande genoma nucleare (16.5 Gbp per 1C, ~ 6X più grande di quello di riso e di mais), caratterizzato da una alta presenza di sequenze ripetute e un basso contenuto in GC (32%) confrontato a qualsiasi altra angiosperma. E' stata anche osservata nella specie una forte influenza materna, ma sono pochi gli studi e i dati disponibili per chiarirne i meccanismi molecolari. Il principale obiettivo di questo Dottorato di ricerca era quello di studiare l'effetto materno per un numero di tratti agronomici in cipolla. A causa della alta eterozigosità della specie, sono stati prodotti alcune linee Doppie Aploidi (DH) da genotipi di cipolla contrastanti per sensibilità al fotoperiodo e per colore del bulbo. Questo ha permesso di ridurre enormemente la variazione allelica ad ogni locus e quindi semplificare l'analisi dei dati, oltre alla valutazione degli effetti materni dei differenti caratteri. Inizialmente è stata studiata, attraverso accurati tests fisio-patologici, la tolleranza al Fusarium oxysporum f. sp. cepae (FOC), un comune fungo del terreno e agente causale del marciume basale della cipolla che colpisce gravemente sia la produzione in campo aperto che la conservazione dei bulbi in magazzino, al fine di analizzare l'ereditabilità e la penetranza del carattere. I tests avevano lo scopo di caratterizzare tutte le linee DH per la loro tolleranza al FOC nelle prime fasi di sviluppo della pianta al fine di identificare linee con un differente comportamento per l'interazione ospite-patogeno. Sono stati trovati interesessanti risultati durante la valutazione e sono stati identificati una linea DH con una ottima tolleranza e due linee DH con una alta sensibilità al patogeno. Questo ci ha permesso di incrociare le linee fra di loro per ottenere F1 e RF1 utili a valutare l'effetto materno. Parallelamente, sono stati allestiti campi prova e le piante sono state fenotipizzate per alcuni tratti agronomici importanti della parte epigea come: tasso di grescita, portamento delle foglie, cera fogliare, crancking, ecc... Stesso tipo di fenotipizzazione è stato effettuato per il bulbo, quindi è stato annotato numero, aderenza e colore delle tuniche cartacee, serbevolezza del bulbo ecc.... In uno studio complementare, sono stati utilizzati analisi bioinformatiche per identificare in silico un set di gene candidati ortologhi dei maggiori componenti di importanti tratti evolutivi (come le vie metaboliche del fotoperiodo e della vernalizzazione) in colture e specie modello. Piante di specifici F1, RF1 e le loro linee parentali caratterizzate da genotipi contrastanti sono state utilizzate in uno screening alla ricerca di polimorfismi in geni candidati al fine di trovare SNPs informativi tra le diverse tipologie di cipolla. In oltre, è stato analizzato lo stato globale della metilazione del genoma nello stesso materiale, utilizzando la tecnica di laboratorio chiamata “methylation-sensitive amplified polymorphism” (MSAP) per quantificare i differenti livelli di metilazione. Le informazioni ottenute in questo progetto saranno utili nel breeding della cipolla perchè permetterà di ideare un programma considerando l'effetto materno e conseguentemente di meglio sfruttare il potenziale del materiale vegetale usato dai breeders.
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Abstract
Onion (Allium cepa L.) is one of the most important vegetable crops in the world and, although its importance, can be considered an “orphan crop” as it has received little attention from researchers compared to the other monocot species like rice, maize and wheat. Plant pathology and molecular information useful for improving the existing breeding programs inside the species are lagging behind major commercial crops, mainly because the onion genome is too complex to sequence or characterize. A. cepa L. (2n=16) is a biannual allogamous plant, with a very large nuclear genome (16.5 Gbp per 1C, ~ 6X larger than rice and maize), characterized by a high presence of repeated sequences and a low GC content (32%) compared to any other angiosperm. A strong maternal influence has also been observed in the species, but few studies are nowadays available to clarify the molecular mechanisms underlying this effect.
The main objective of this PhD research was to study the maternal effect on a number of agronomic traits in onion. Due to the high heterozygosity of the species, several Double Haploids (DH) lines were produced from onion genotypes contrasting for photoperiod sensitivity and bulb colour. This allowed us to greatly reduce allelic variation at each locus and thus simplify data analyses, besides the evaluation of maternal effects on different traits.
First of all, the tolerance to Fusarium oxysporum f. sp. cepae (FOC), a common soil fungus and the causal agent of the basal rot of onion, that severely affects onion production in the open field and bulbs storage in stock, was studied through an accurate physio-pathological tests in order to understand heritability and penetrance of the trait. The tests aimed to characterize all DH lines for their tolerance to FOC at the beginning of plant development in order to identify lines with a different behaviour for the host-pathogen interaction. Interesting results were found during the evaluation and a DH line with optimal tolerance and two DH lines with an high susceptibility to the pathogen were identified. This has allowed us to cross these lines with each other to derive reciprocal F1 and RF1 progenies useful to assess the maternal effects by comparing their behaviour to that of the parent lines against to the fusariosis.
At the same time, field trials were set up and plants were phenotyped for several important agronomic traits of epigeal part such as: growth rate, leaf erectness, leaf waxiness, leaf crancking, ecc... Same type of phenotyping has been conducted for the bulb, so it has been annotated number of dry skin, dry skin retention, dry skin color, bulb firmness, ecc...
In a complementary study, bioinformatic approaches were applied to identify in silico a set of candidate genes orthologous of major determinants for important developmental traits (i.e. photoperiod sensitivity and vernalization requirement) in model and crop species. Plants of specific F1, RF1 and their parental lines with contrasting genotypes has been used in a screening for DNA polymorphisms in candidate genes in order to find informative SNPs among the different onion typology. The origin of DH lines used for this analysis was cv. Cipolla di Tropea (Red Short Day Onion), cv. Bianca di Pompei (extra early White Short Day Onion), a common commercial Hybrid (Red Long Day Onion) and a "Density" typology (Yellow Long Day Onion ). Moreover, the global methylation status of the genome was derived in the same material, using the methylation-sensitive amplified polymorphism (MSAP) technique to quantify different levels of methylation. The information obtained during this project will be useful in onion breeding because it will allow to design a program taking in account the maternal effect and better exploit the potential of the plant material used by the breeders.
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