Riassunto analitico
Il genome editing è una rivoluzionaria tecnologia di terapia genica che consente modifiche precise nel genoma. Per indurre alterazioni sito-specifiche, l'editing del genoma sfrutta la formazione di rotture a doppio filamento del DNA e il conseguente riparo della sequenza genomica tramite la ricombinazione omologa (HR) o la giunzione delle estremità non omologhe (NHEJ). Tra le tecnologie recentemente sviluppate, i metodi basati su Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein (CRISPR/Cas) sono particolarmente promettenti. In particolare, il sistema CRISPR/Cas9 è stato adattato dal sistema immunitario di Streptococcus pyogenes. Il sistema CRISPR/Cas9 ingegnerizzato richiede due componenti: l'endonucleasi Cas9 e l’RNA guida (gRNA) che conduce la Cas9 verso una sequenza specifica. Il sistema CRISPR/Cas9 ha fornito un nuovo strumento per l’accurata manipolazione della sequenza genomica.
Questa tesi descrive il targeting specifico da parte di CRISPR/Cas9 di due mutazioni de novo eterozigoti nei geni COL6A, le quali hanno un effetto dominante negativo sulla secrezione del collagene VI. Queste mutazioni causano la distrofia muscolare congenita di Ullrich (UCMD), la forma più grave delle miopatie correlate al collagene, per la quale attualmente non esiste una terapia curativa. Una down-regolazione permanente dell’allele mutato dei geni COL6A rappresenta un possibile intervento terapeutico. Di conseguenza, lo scopo della tesi è dimostrare che il knock-out (KO) mediato da CRISPR/Cas9 dell'allele mutato consente la sintesi della forma wild-type (wt) del collagene VI nei fibroblasti dei pazienti UCMD. Per bersagliare le mutazioni identificate in due pazienti UCMD (pazienti #5 e #18), sono stati disegnati due gRNAs. Il gRNA5 bersaglia l’allele mutato del gene COL6A1 del paziente #5, mentre il gRNA18 è specifico per l’allele mutato del gene COL6A2 del paziente #18. I gRNAs sono stati clonati separatamente in plasmidi che esprimono la Cas9 di Streptococcus pyogenes umanizzata (hSpCas9) per ottenere i plasmidi effettori. Per valutare la specificità del targeting tra l’allele mutato e wt, sono stati generati i templati plasmidici che contengono il frammento mutato o wt dei geni affetti. I plasmidi effettori e i templati plasmidici sono stati adeguatamente co-trasfettati in cellule HEK293T. L’efficienza di taglio sui templati wt e mutato e gli off-target predetti sono stati verificati tramite sequenziamento Sanger e analisi di Tracking of Indels by Decomposition (TIDE). Una volta dimostrata la specificità del disegno dei gRNAs, il sistema CRISPR/Cas9 è stato testato nei fibroblasti derivati dai pazienti #5 e #18 e da donatore sano. A tale scopo, è stato messo a punto un protocollo di trasfezione basato su ribonucleoproteine (RNP) per trasfettare i fibroblasti primari con i complessi gRNA-proteina SpCas9. L'editing sugli alleli wt e mutati nei geni COL6A è stato valutato mediante analisi di TIDE sul DNA genomico. L'effetto del trattamento sull'espressione dell'mRNA di COL6A1 e di COL6A2 è stato valutato mediante RT-PCR semiquantitativa. Infine, il recupero della secrezione di collagene VI è stato determinato mediante immunofluorescenza. La caratterizzazione dei fibroblasti UCMD ha mostrato l'assenza di collagene VI extracellulare, presente invece nei fibroblasti wt. Il KO mediato da CRISPR/Cas9 degli alleli mutati nei geni COL6A nei fibroblasti UCMD ha provocato un aumento della secrezione di collagene VI rispetto alle cellule non trattate. In conclusione, questa tesi rappresenta una prova di principio dell’applicazione del sistema CRISPR/Cas9 per eliminare selettivamente le mutazioni dominanti nei geni COL6A che causano UCMD, aprendo nuove possibilità per il trattamento delle miopatie correlate al collagene VI.
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Abstract
Genome editing is a revolutionary gene therapy technology enabling precise changes in the genome. To induce gene knock-out (KO), gene addiction or correction, this technology exploits the formation of DNA double strand breaks (DSB) and the consequent DNA repair through homologous recombination (HR) or non-homologous end joining (NHEJ). The site-specific DSB can be induced by programmed endonucleases. Among the recently developed genome editing technologies, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein (CRISPR/Cas)-based methods are particularly promising. In particular, CRISPR/Cas9 system was adapted from Streptococcus pyogenes immune system. The engineered CRISPR/Cas9 system requires two components: the endonuclease Cas9 and the guide RNA (gRNA) that tether the Cas9 to a specific sequence. Thanks to its feasibility and easy-to-use, CRISPR/Cas9 system has provided a new popular tool for accurate manipulation of genomic sequence.
This thesis describes a CRISPR/Cas9-specific targeting of two heterozygous de novo mutations in COL6A genes exerting a dominant negative effect on collagen VI assembly and secretion. These defects lead to Ullrich congenital myopathy disorder (UCMD), the most severe form of collagen VI-related myopathies. Despite few pharmacological therapeutic attempts currently underway or upcoming, there is no curative therapy for this disease. A permanent down-regulation of the mutated COL6A allele represents a possible therapeutic intervention. Consequently, the aim of the thesis is to demonstrate that CRISPR/Cas9-mediated KO of the mutated allele enables the synthesis of the wild-type (wt) form of collagen VI in fibroblasts of UCMD patients. To specifically target the mutations identified in two UCMD patients (patients #5 and #18), two gRNAs were designed. In particular, gRNA5 is tailored to mutated COL6A1 allele of patient #5 and gRNA18 is specific for mutated COL6A2 allele of patient #18. The designed gRNAs were separately cloned in plasmids expressing the humanized S. pyogenes Cas9 (hSpCas9) to obtain the effector plasmids. To assess the targeting specificity between mutated and wt allele, template plasmids bearing a wt or mutated fragment of the affected genes were generated. The effector and template plasmids were properly co-transfected in HEK293T cells. The cleavage efficiency on wt and mutated templates and the genome-wide predicted off-targets were verified by Sanger sequencing and Tracking of Indels by Decomposition (TIDE) analysis. Once demonstrated the specificity of the gRNAs design in HEK293T cells, the CRISPR/Cas9 system was tested in fibroblasts derived from patient #5, #18 and healthy donor. To this aim, a ribonucleoprotein (RNP) transfection protocol was set up to deliver gRNA-SpCas9 complexes in primary fibroblasts. The editing on wt and mutated alleles in COL6A genes was assessed by TIDE analysis on genomic DNA. The effect of CRISPR/Cas9 treatment on the expression of COL6A1 and COL6A2 mRNA was evaluated by semiquantitative RT-PCR. Finally, the restoration of the collagen VI secretion was determined by immunofluorescence. A previous characterization of UCMD fibroblasts showed the absence of extracellular collagen VI, differently from the wt fibroblasts where collagen VI forms a beaded microfilament network in the matrix. CRISPR/Cas9-mediated KO of COL6A mutated alleles in UCMD fibroblasts resulted in increased secretion of collagen VI, compared to untreated cells. In conclusion, this thesis represents a proof-of-principle application of CRISPR/Cas9 system to selectively disrupt COL6A dominant mutations leading to UCMD, opening new possibilities for the treatment of collagen VI-related myopathies.
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