Riassunto analitico
In studi precedenti abbiamo dimostrato che in pazienti affetti da Leucemia Linfatica Acuta positiva per il cromosoma Philadelphia (Ph+ALL) si osserva la comparsa di linfociti T citotossici (CTLs) specifici per BCR-ABL, durante terapia di mantenimento con Imatinib (IM) o inibitori delle tirosin-chinasi (TKIs) di seconda generazione (Dasatinib, Nilotinib), e che la loro frequenza è inversamente correlata al valore di malattia minima residua (MRD) [Riva et al., Blood 2010; Riva et al., BCJ 2011]. Questi dati suggeriscono che i CTLs specifici per BCR-ABL possano essere coinvolti nel controllo della malattia. L’obiettivo di questo progetto è quindi quello di valutare se i linfociti T specifici per BCR-ABL possano essere usati sia come nuovo fattore prognostico che come fonte per una immunoterapia adottiva (autologa o eterologa) in pazienti affetti da Ph+ALL con persistente MRD, nonostante terapia di mantenimento con TKIs e/o trapianto allo genico di cellule staminali ematopoietiche (alloHSCT). Quindi, sono stati generati con successo CTLs specifici per BCR-ABL da colture in vitro a lungo termine di cellule mononucleate di sangue periferico (PBMCs) in 8 dei 12 pazienti arruolati. Le cellule sono state stimolate con antigeni specifici della leucemia, ovvero un pool di peptidi di 9-20 mers, derivati dal completo spanning della regione di fusione della proteina chimerica BCR-ABL. Analisi funzionali pre-cliniche hanno dimostrato che queste linee di CTLs hanno una elevata e specifica produzione di IFNg, ed una attività litica contro i target leucemici, con limitata alloreattività. In particolare, 3 dei pazienti arruolati sono stati trattati in modo compassionevole con infusioni mensili di dosi incrementali di CTLs specifici per BCR-ABL, di origine eterologa (pazienti 1 e 2), e autologa (paziente 3): 1) il paziente 1 mostrava recidiva molecolare dopo trapianto 2) il paziente 2 mostrava recidiva molecolare dopo alloHSCT, rapidamente progredita a franca recidiva ematologica, nonostante trattamento con IM/Nilotinib in associazione ad infusione di linfociti del donatore non manipolati (DLI); 3) il paziente 3, non trapiantato, mostrava livelli di MRD persistentemente elevati, nonostante una prolungata terapia di mantenimento con IM ad alte dosi. Dopo ogni infusione i pazienti sono stati monitorati per valutare la presenza di linfociti T BCR-ABL-specifici, sia nel midollo osseo che nel sangue periferico, mediante IFNg ELISPOT (Enzyme-Linked Immunospot) e CSA (Cytokine Secretion Assay). Nessuno dei 3 pazienti ha sviluppato tossicità acuta o cronica, e in due dei tre pazienti è stata raggiunta la remissione completa molecolare (CMR), associata a rapido recupero dei linfociti T BCR-ABL-specifici secernenti IFNg. Questi dati dimostrano che l’infusione di CTLs specifici per BCR-ABL risulta sicura per i pazienti e può avere una rilevanza clinica nel controllo della MRD.
In parallelo, abbiamo studiato la fattibilità della sospensione della terapia con TKI in pazienti con Ph+ALL con stabile e duratura CMR, per valutare le implicazioni prognostiche del monitoraggio dei CTLs BCR-ABL-specifici. Abbiamo quindi monitorato, mediante CSA, la presenza dei linfociti BCR-ABL-specifici in campioni midollari di una paziente anziana con Ph+ALL che ha interrotto la terapia di mantenimento con IM dopo più di 7 anni di CMR. Dopo la sospensione di IM, le analisi molecolari e immunologiche hanno evidenziato il mantenimento della CMR e la persistenza di linfociti T BCR-ABL-specifici, principalmente EMRA, in grado di produrre IFNg, senza differenze significative in valori medi rispetto al follow-up in terapia con IM [Riva et al., BJH 2013]. Questi dati sottolineano che i linfociti T specifici per BCR-ABL possono persistere a lungo in seguito alla sospensione di IM e hanno un ruolo nel controllo della malattia. Inoltre, l’elevata frequenza di EMRA specifici potrebbe rappresentare un nuovo marker immunologico di efficace protezione anti-leucemica.
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Abstract
We have previously reported that BCR-ABL-specific T cells may be detected in the bone marrow (BM) of Ph+ALL patients during treatment with either Imatinib (IM) alone or second generation tyrosine kinase inhibitors (TKIs), and that their frequencies inversely correlated with minimal residual disease (MRD) values [Riva et al., Blood 2010; Riva et al., BCJ 2011], suggesting that BCR-ABL-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) may be involved in the control of the disease. On this basis, the aim of this study is to investigate whether such specific T cells may be harnessed either as a novel prognostic factor or as an innovative T-cell therapy (autologous or allogeneic) in Ph+ALL patients with evidence of MRD despite TKI maintenance treatment or after allogeneic hematopoietic stem cell transplant (alloHSCT), respectively.
Thus, BCR-ABL-specific CTLs were successfully generated from long-term in-vitro cultures of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in 8/12 patients, stimulated with a leukemia-specific antigen, namely a mixed pool of 9-20mer peptides, deriving from the complete spanning of BCR-ABL (p190/p210) junctional region and alternative splicing. Pre-clinical functional analyses of such CTL lines showed highly-specific IFNg production and lytic activity toward leukemic targets, with limited alloreactivity.
So far, 3 Ph+ALL patients, were compassionately treated with monthly incremental doses of BCR-ABL-specific CTLs (from 1x105/Kg to 5x105/Kg in pt.1; from 0,1x106/Kg to 2,3x106 in pt.2; from 1x106/Kg to 3x106/Kg in pt.3;), allogeneic in the case of patients 1 and 2, autologous in the third:
1) pt.1 showed molecular relapse 3 years after alloHSCT;
2) pt.2 showed molecular relapse after alloHSCT, rapidly followed by hematologic relapse, and persisting MRD despite donor lymphocyte infusion and IM/Nilotinib treatment;
3) pt.3 showed persistently high MRD levels albeit prolonged high-dose IM therapy.
We performed a broad immunological monitoring for quantitation and functional/phenotypic profiling of BCR-ABL-specific T-cell responses on monthly BM and PB samples, by applying IFNγ-Elispot and Cytokine Secretion Assays (CSA) for IFNγ, IL-2 and TNFα. None of the patients experienced any acute or late toxicities and 2 patients (pt.1 and 3) obtained complete molecular remission (CMR), associated with a prompt recovery of BCR-ABL-specific IFNγ-producing BM T cells. These data show the safety of BCR-ABL-specific CTL infusion and its possible clinical relevance in MRD control.
In parallel, we have also tried to evaluate the feasibility of TKI suspension in Ph+ALL patients with stable and durable CMR, thus exploiting the prognostic value of BCR-ABL-specific T-cell monitoring. On the basis of recent studies in the setting of chronic myeloid leukaemia (CML), reporting that about half of patients maintained a persistent CMR after IM withdrawal, we decided to stop IM maintenance therapy in an elderly Ph+ALL patient after a durable CMR (>7 years). The immunological monitoring to analyze the presence of BCR-ABL-specific T cells was performed by applying CSA, during IM maintenance therapy and after IM discontinuation.
After IM discontinuation, we observed both CMR maintenance as well as the persistence of BCR-ABL-specific BM CTLs, mainly IFNg-secreting EMRA, without significant differences in median values, when compared to the previous immunological follow-up [Riva et al., BJH 2013].
These data highlights that BCR-ABL-specific CTLs can persist long after TKI withdrawal and have a role in disease control. Moreover, remarkably high frequencies of specific EMRA CTLs could represent a novel immune marker of effective anti-leukaemic protection, useful to guide the suspension of TKIs in selected Ph+ALL patients exhibiting long-term CMR along with detectable BCR-ABL-specific CTLs. Furthermore, in case of relapse after TKI discontinuation, ex-vivo expanded BCR-ABL-specific CTLs could be usefully exploited as autologous T-cell therapy.
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