Riassunto analitico
La famiglia dei fattori trascrizionali MEF2 (Myocite Enhancer Factor-2) è composta da quattro membri (MEF2A-B-C-D) la cui funzione durante lo sviluppo e nel mantenimento dei tessuti sono state ampliamente descritte. Tra i quattro membri della famiglia, MEF2C svolge un ruolo fondamentale durante la miogenesi del tessuto muscolare cardiaco e scheletrico e la sua attività può essere finemente regolata da eventi di splicing alternativo che sono conservati tra i vertebrati. Il pesce Danio rerio (zebrafish) possiede due geni paraloghi di mef2c, mef2ca e mef2cb che derivano da un evento di duplicazione genomica specifico dei Teleostei. Sebbene entrambi i paraloghi siano espressi precocemente nei precursori cellulari cardiaci e muscolari, l'analisi del profilo di espressione genica indica che mef2ca ha una espressione predominante durante lo sviluppo che è prevalente nel tessuto muscolare scheletrico, mentre mef2cb è maggiormente espresso nel tessuto cardiaco. Al fine di caratterizzare la funzione di mef2ca e mef2cb durante lo sviluppo embrionale di zebrafish sono state condotte analisi di RT-PCR agli stadi di 12, 24, 48 e 72 hpf (hours post fertilization). Tramite queste analisi ho osservato eventi di splicing che coinvolgono la regione degli esoni 4, 5 e 6, portando alla produzione di tre diverse varianti di mRNA che differiscono in base alla presenza o assenza dell'esone 5 o di una regione più ampia che comprende parte dell'esone 4 e parte dell'esone 6. I dati ottenuti dimostrano che a partire da 24 hpf i trascritti che presentano l'esone 5 nella propria sequenza codificante risultano predominanti rispetto alle altre varianti di splicing, questo dato acquisisce importanza considerando che questo specifico stadio di sviluppo è caratterizzato dall'inizio del differenziamento terminale del tessuto scheletrico muscolare. Inoltre, dati ottenuti in vitro dimostrano che le isoforme di mef2ca che mancano dell'esone 5 mef2ca mostrano una significativa riduzione della capacità transattivante. Mediante saggi di in situ hybridization a 24 hpf è stata rilevata un'arrichita espressione nel tessuto muscolare scheletrico dei trascritti contenenti esone 5, i quali mostrano una localizzazione specifica alle estremità della fibra muscolare nel punto di giunzione tra i somiti, regione in cui l'espressione dei trascritti di mef2c è circoscritta solo in fasi più tardive dello sviluppo. L'iniezione dell' mRNA codificante per l'isoforma di mef2ca contenente l'esone 5 influenza drammaticamente il progredire dello sviluppo embrionale. Infatti, a seguito dell'iniezione, una porzione di embrioni presenta un fenotipo caratterizzato dalla formazione di un doppio asse dorsale; tale osservazione è coerente con la maggiore attività della isoforma contenente l'esone 5 di indurre un aumento dell'espressione di geni profondamente coinvolti nella definizione dorso-ventrale dell'embrione quali nodal related 1 (ndr1), goosecoid (gsc) e chordin (chd). Al contrario le analisi condotte non hanno rilevato la presenza di trascritti di mef2cb che manchino dell'esone 5, tuttavia l'isoforma di splicing di mef2cb predominante durante lo sviluppo presenta nella sua sequenza codificante una porzione dell'introne 5 derivante da un processo di esonizzazione. L'iniezione di questa isoforma è in grado di indurre la formazione ectopica di tessuto muscolare scheletrico nel mesoderma della testa. Questo lavoro evidenzia quindi l'importanza del meccanismo di splicing alternativo nel modulare e conferire attività differenti ai fattori mef2ca e mef2cb durante lo sviluppo embrionale di Danio rerio.
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Abstract
MEF2 (Myocite Enhancer Factor-2) family of transcription factors has four member (MEF2A-B-C-D) whose functions during body development and manteinance are well-established. Among the members, mef2c has a unique role during cardiac and skeletal myogenesis and several reports described how alternative splicing can regulate its activity and that those splicing patterns are conserved among vertebrates. Zebrafish Danio rerio possess two mef2c paralogues, mef2ca and mef2cb that arise from a Teleost-specific genome duplication event. Both genes are expressed early in the embryo in myogenic and cardiac precursors, however expression pattern analysis indicates that among the two paralogues mef2ca expression is higher throughout development and mainly in skeletal muscle whereas mef2cb transcripts are detected in heart primordium. With the goal to gain insight into the function of mef2ca and mef2cb I analyzed their mRNA splicing patterns during embrionic development, focusing the analysis at 12, 24, 48 and 72 hpf (hours post fertilization). RT-PCR analysis revealed the occurence of alternative splicing events, within exon 4, 5 and 6 of mef2ca, that give rise to three different splicing variants. My work demonstrates that inclusion of exon 5 becomes predominant starting from 24 hpf, a developmental stage charachterized by the onset of skeletal muscle terminal differentiation. I further demostrate that Mef2ca isoforms lacking this sequence are significantly less efficient in activating Mef2-dependent transcription, therefore exon 5 inclusion enhances Mef2ca transcriptional activity. By in situ RNA hybridization at 24 hpf I found that the expression of transcripts containing exon 5 is enriched in skeletal muscle showing a specific localisation at fiber ends, facing somite-somite junctions where mef2ca expression is restricted at later stages. Furthermore in-vivo mRNA injection of full-lenght mef2ca dramatically affected embryonic development. Coherently with the occurence of double axis phenotype in a fraction of injected embryos, full-lenght mef2ca has the ability to drive, directly or non-directly, expression of nodal related 1(ndr1), goosecoid (gsc) and chordin (chd), which are deeply involved in the regulation of early dorso-ventral patterning of the embryo. By contrast regulated alternative splicing on mef2cb mRNA to exclude exon 5 during development was not observed. However, I demonstrate that a longer splicing isoform derived from exonization of a fragment of intron 5 is predominant throughout development. Intriguingly, mRNA injection of this long isoform is able to induce ectopic muscle in head mesoderm. My work provide evidence that both zebrafish mef2ca and mef2cb function is regulated through splicing events occuring within exon 5 region. In conclusion alternative splicing confers unique activities to mef2ca and mef2cb paralogues during Danio rerio development.
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