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I microRNA costituiscono una classe di small RNA con un ruolo di fondamentale importanza in processi biologici chiave nelle piante, come lo sviluppo e la risposta a stress ambientali. Regolano l’espressione genica agendo principalmente a livello post-trascrizionale, attraverso il riconoscimento di una sequenza a loro complementare nell’RNA messaggero target.
Fino ad oggi sono stati prodotti molti lavori aventi come argomento i microRNA in pianta, ma solo pochi di questi hanno riguardato specie di interesse agrario come orzo e frumento.
Questa tesi aveva l’obiettivo di esplorare il ruolo dei microRNA in diverse condizioni ambientali e in diverse specie vegetali.
Per fare ciò, sono stati predisposti quattro esperimenti.
Il primo esperimento ha visto il confronto di linee euplasmiche di frumento tenero con corrispondenti linee alloplasmiche, nelle quali era avvenuta una sostituzione di citoplasma con quello di altre specie evolutivamente collegate. L’obiettivo era lo studio di eventuali microRNA coinvolti nel cross-talk tra il genoma nucleare e quello degli organelli citoplasmatici.
Il secondo esperimento ha riguardato lo studio dello sviluppo del pesco, considerando campioni provenienti da 5 fasi fenologiche tra rottura delle gemme e fioritura. L’analisi bioinformatica si è focalizzata sulle isoforme generate dai diversi loci genomici, ed ha delineato la sorprendente complessità del miRNoma di pesco.
Il terzo esperimento si proponeva di esplorare la risposta dell’orzo all’acclimatamento. Nure e Tremois, due cultivar di orzo rispettivamente invernale e primaverile, sono state esposte a basse temperature (4° C) per un tempo variabile tra 2 ore e 6 giorni. Un interessante risultato ha riguardato il miR397, il cui trend di espressione è probabilmente associato all’habitus di crescita. Questa correlazione è stata ulteriormente studiata in un panel di 24 varietà di orzo comprendente tipi primaverili, invernali e facoltativi.
Il quarto esperimento aveva come obiettivo la caratterizzazione della risposta del frumento duro allo stress da siccità e da calore a livello di microRNA. Sono state scelte due cultivar, Ofanto e Cappelli, per il loro comportamento contrastante in tali condizioni. Le piante sono state esposte a stress in terza foglia (calore – 3 ore a 36° – oppure siccità, con due livelli finali di Soil Water Content del 18% e del 12.5%).
Da questi quattro esperimenti sono state costruite 69 librerie, poi sequenziate con un Illumina Genome Analyzer IIx.
Per quanto riguarda gli ultimi due esperimenti, i dati provenienti dalla corsa sono stati analizzati con un programma freeware che ha permesso l’identificazione dei microRNA la cui sequenza matura fosse già annotata e presente nel database miRBase.
E’ stata messa a punto una procedura standardizzata e ripetibile per la validazione dei dati Illumina, basata su una strategia di qPCR facente uso di primer stem-loop. I dati di espressione dei microRNA sono stati normalizzati con geni housekeeping classici e con normalizzatori appartenenti alla classe degli small RNA.
Successivamente è stata effettuata una ricerca bioinformatica dei target dei miRNA differenzialmente espressi negli esperimenti di orzo e frumento, utilizzando il programma Plant Small RNA Target, ed è stata ottimizzata una procedura di RACE per la validazione sperimentale di queste predizioni.
Infine sono state preparate delle particolari librerie di prodotti di degradazione, che sono state sequenziate con un Illumina HiSeq 2500. Il trend di espressione dei putativi geni target identificati è stato analizzato mediante qPCR.
I risultati ottenuti costituiscono un passo in avanti nella comprensione del meccanismo d’azione di questi piccoli regolatori endogeni e dei network complessi che governano il comportamento delle piante in processi come sviluppo e risposta a stress ambientali, e pongono le basi per studi futuri sulle interazioni geniche che regolano questi processi.

MicroRNAs are a class of small RNAs with fundamental roles in key plant biological processes, such as development and environmental stress response. They act on gene regulation mainly at post-transcriptional level through sequence-based interaction with target mRNAs. Until now several studies on plant microRNAs have been carried out, but only few of them focused on a deep characterization of their functions in species of agricultural interest like wheat and barley. This thesis set out to unravel the roles of microRNAs in different environmental conditions and different plant species. To do so, four ad-hoc experiments were set up and a deep sequencing of small RNA transcriptomes was carried out. The first experiment consisted in a comparison between bread wheat euplasmic and alloplasmic lines, in which the substitution of the wheat cytoplasm with alien cytoplasm occurred. It aimed at the investigation of a possible regulation of microRNAs involved the crosstalks between the nuclear and the organellar genomes. The second experiment concerned the study of the peach tree development, taking into consideration five different organs and/or phenological stages, in which the small RNA population was characterized. The bioinformatic analysis focused on isomiRs generated from each locus, and outlined the surprising complexity of the peach miRNome. In the third experiment the barley response to acclimation was explored. Two cultivars, Nure and Tremois, a winter and a spring type, respectively, were exposed to low temperatures (4° C) at the first-leaf stage for a time ranging from 2 hours to 6 days. Several cold-related microRNAs were found. Moreover, an interesting result was found for miR397. It showed an expression trend likely associated with the growth habit. This correlation was further analyzed in a new panel of 24 spring, winter and alternative barley cultivars. The fourth experiment explored the durum wheat response to high temperatures and drought stress at microRNA level. Two cultivars, Ofanto and Cappelli, were chosen for their contrasting behavior in these conditions, and exposed to a stress treatment, i.e. heat stress (3 hours at 36 °C) or drought stress (two levels with final Soil Water Content of 18% and 12.5%, respectively). Sixty-nine small RNA libraries were prepared from samples coming from these four experiments and sequenced on an Illumina Genome Analyzer IIx. Concerning the last two experiments, all bioinformatic analyses were carried out with a free, web-available tool that allowed the identification of microRNAs whose mature sequence was already annotated in miRBase. Subsequently a standardized and reliable qRT-PCR method based on the use of stem-loop primers was developed to validate Illumina results. MicroRNAs expression data were normalized with different classic housekeeping genes. Reference genes belonging to the small RNA class were considered as well, and good results came from some barley and wheat small nucleolar RNAs (snoRNAs), namely Hvu-U59 and Hvu-U61 for barley, and Ta-snoR10 for wheat. An in silico target search for differentially expressed barley and wheat microRNAs was carried out with the free Plant Small RNA target tool, and a 5’ RACE procedure for experimental validation of these targets was optimized. Finally, special degradome libraries from the wheat experiment were prepared and sequenced on an Illumina HiSeq 2500. The expression trend of identified putative target genes in control and stressed samples was checked by qPCR, using primers straddling the miRNA cleavage site. The results obtained shed new light on the complex networks underlying plants behavior during processes such as development and response to stresses, and represent a step forward in the understanding of the mechanism of action of these tiny regulators. They also provide a useful starting point for future studies on genes interactions regulating these key biological processes.