Riassunto analitico
Il melanoma cutaneo (CM) è la forma più letale di cancro della pelle. Il tasso di sopravvivenza a cinque anni è di circa il 98%, ma in presenza di metastasi regionali o distanti questo tasso si riduce fino al 64% al 23% rispettivamente. I melanomi sono raggruppati dalla classificazione dell'Organizzazione mondiale della sanità (OMS) in sottotipi in base alle caratteristiche cliniche e istologiche. I sottotipi principali sono il melanoma a diffusione superficiale (SSM), il melanoma nodulare (NM), il melanoma lentigo maligna (LMM) e il melanoma desmoplastico (DM). La conoscenza dello stadio del tumore è importante per la valutazione della prognosi e della gestione dei pazienti. Lo stadio del melanoma è definito da diversi fattori istologici tra cui lo spessore del tumore (spessore di Breslow), la regressione e la presenza di metastasi. Lo spessore di Breslow (BT) è un fattore importante che definisce quanto il tumore invade lo strato cutaneo. Generalmente, i melanomi sottili (BT <0,8 mm) metastatizzano raramente. L’obiettivo di questa tesi è di identificare microRNA tumorali che possano fungere da biomarcatori nella diagnosi e prognosi di pazienti con melanoma, analizzando la loro associazione con BT, regressione e metastasi. Abbiamo analizzato il profilo di espressione dei microRNA di 26 nevi e melanomi allo stadio iniziale utilizzando due diverse tecnologie di Next Generation Sequencing (NGS). Il sequenziamento di piccoli RNA (small RNA-seq) è stato ottenuto utilizzando i kit QIAseq miRNA Library kit (Qiagen) e TruSeq Small RNA Library Preparation Kit v2 (Illumina) su RNA estratto da campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE). I dati di espressione normalizzati dei miRNA sono stati analizzati per ottenere un elenco di 39 miRNA espressi in modo differenziale nel nevo rispetto al melanoma. Abbiamo eseguito un'analisi di arricchimento delle vie di segnalazione su questi miRNA. MicroRNA specifici sono stati convalidati in RT-qPCR e correlati con i dati clinici. L'espressione dei miRNA è stata analizzata per identificare un'associazione con BT, regressione e prognosi. Partendo dai dati di mall RNA-seq, abbiamo identificato i miRNA la cui espressione è correlata con spessore di Breslow e la presenza di regressione. La correlazione tra l’espressione di miR-21-5p e miR-146a-5p con BT è stata valutata in campioni di SSM and NM. Abbiamo anche ottenuto dati preliminari che associano l’espressione di miR-21-5p e miR-126-3p con la regressione in campioni di LMM sottili. I nostri risultati hanno suggerito che l'espressione di alcuni specifici miRNA siasignificativamente correlata con BT in SSM. Inoltre, abbiamo identificato una differenza significativa nell'espressione dei alcuni miRNA associati alla regressione e, potenzialmente, alla prognosi in campioni di LMM sottili. Abbiamo dimostrato che l'espressione di miRNA potrebbe essere misurata efficacemente in campioni di melanoma fornendo informazioni prognostiche e diagnostiche e, pertanto, migliorando la gestione dei pazienti.
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Abstract
Cutaneous melanoma (CM) is the most lethal form of skin cancer. The five-year survival rate is around 98%, but when regional or distant metastasis is present this rate drops to 64% and 23%, respectively. Melanomas are grouped by the World Health Organization (WHO) classification into subtypes according to clinical and histologic characteristics. The main subtypes are superficial spreading melanoma (SSM), nodular melanoma (NM), lentigo maligna melanoma (LMM), and desmoplastic melanoma (DM). The knowledge of tumor stage is important for the evaluation of patients' prognosis and management. The melanoma stage is defined by several histological factors including tumor depth (Breslow thickness), regression and presence of metastases. Breslow thickness (BT) is an important factor that defines how far the melanoma has advanced into the skin layer. Generally, thin melanomas (BT<0.8 mm) rarely metastasize. However, the BT determination could be incorrect due to the inter-observer variability with a possible bias in tumor staging and prognosis assessment.
This thesis aimed to identify microRNAs that could serve as biomarkers for the diagnosis and prognosis of melanoma patients, specifically assessing their association with BT, regression, and metastasis.
We analyzed the microRNA expression profile of 26 nevi and early stage melanomas using two different Next Generation Sequencing (NGS) technologies. We obtained the small RNA-sequencing data using kit QIAseq miRNA Library kit (Qiagen) and TruSeq Small RNA Library Preparation Kit v2 (Illumina) on RNA extracted from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) samples. Normalized miRNA expression data were used to obtain a list of 39 miRNAs differentially expressed in nevus vs. melanoma. We performed a pathway enrichment analysis on these miRNAs. Specific microRNAs were validated by RT-qPCR.
MiRNA expression was analyzed to identify an association with BT, regression and prognosis. Starting from the small RNA-seq data, we identified miRNAs whose expression correlates with Breslow thickness. miR-21-5p and miR-146a-5p expression correlation with BT in a larger cohort of SMM and NM samples. We obtained also preliminary data associating miR-21-5p and miR-126-3p expression and metastasis or regression in thin LMM samples.
Our results suggested that the miRNA expression significantly correlates with BT in SSM. Moreover, we identified a significant difference in miRNA expression associated with regression and potentially with prognosis in thin LMM. We demonstrated that miRNA expression could be an effectively measured in archive melanoma samples providing prognostic and diagnostic information and thus potentially improving patients’ management.
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