Riassunto analitico
La Leucemia Linfatica Cronica (LLC) è la forma di leucemia più frequente dell’adulto nei paesi occidentali. È caratterizzata dall’accumulo di linfociti B monoclonali nel sangue e negli organi linfoidi per difetti intrinseci di apoptosi. La LLC è ad oggi incurabile sebbene siano stati fatti progressi nel trattamento clinico dei pazienti. Da un punto di vista biologico la cellula di LLC instaura un dialogo cellulare con il microambiente tumorale. Infatti la cellula leucemica è in grado di manipolare le cellule circostanti, forzandole a creare una nicchia in cui proliferare, evadere dal controllo del sistema immunitario e resistere all’azione dei farmaci. Tutto ciò comporta una progressiva immunosoppressione, con conseguente elevato rischio di infezioni, ipogammaglobulinemia, disturbi autoimmuni e tumori secondari.
L’indoleamina 2,3-diossigenasi (IDO) avvia la prima reazione di degradazione del triptofano (Trp) in metaboliti attivi, detti chinurenine (Kyn). Le kyn fungono da ligando del recettore degli idrocarburi arilici (AhR), un sensore di xenobiotici con funzioni immunomodulatorie. L’asse IDO-kyn-AhR viene fisiologicamente attivato durante processi flogistici per indurre tolleranza immunologica. È noto che le cellule neoplastiche sfruttano questo meccanismo per sostenere la crescita tumorale. Alcuni studi mostrano infatti che IDO è espresso in diversi tumori solidi e neoplasie ematologiche umane. Nella LLC, l'attività di IDO, misurata come rapporto kyn/trp nel sangue periferico, è risultata aumentata nei pazienti rispetto ai controlli normali.
Alla luce di queste evidenze il lavoro di tesi si è incentrato nel determinare il profilo di espressione di IDO nelle cellule di LLC per valutare i suoi effetti biologici nel complesso contesto del microambiente tumorale.
Gli esperimenti sono stati effettuati su linfociti CD19+ ottenuti da campioni di sangue di pazienti affetti da LLC. È stata dapprima verificata la presenza di IDO nelle cellule di LLC. Analisi di real time PCR e western blot hanno mostrato un’espressione variabile di IDO nei pazienti. Si è valutato l’effetto di molecole presenti nel microambiente tumorale (IFNγ, LPS, anti-IgM, oligo CpG, CD40L+IL-4, TNFα) nella modulazione di IDO. Ciascuno stimolo testato è stato in grado di indurre IDO nelle cellule leucemiche. In seguito, è stata caratterizzata la via di segnalazione dell’IFNγ, il più potente induttore di IDO. Il trattamento con IFNγ induce l’overespressione di IDO insieme all’attivazione di STAT1. L’uso di un inibitore della via di JAK-STAT, ruxolitinib, blocca l’espressione di IDO e la fosforilazione di STAT1. Analizzando l’attività dell’enzima IDO attraverso ELISA nei terreni condizionati delle CD19+ trattate con IFNγ è stata evidenziata la simultanea produzione di Kyn e deplezione di Trp. Questi dati confermano il ruolo attivo del microambiente nell’overespressione della forma attiva di IDO. A questo punto è stato indagato l’effetto del prodotto di IDO sulla cellula leucemica. Le cellule CD19+ trattate con Kyn hanno evidenziato un’aumentata sopravvivenza rispetto ai controlli durante l’analisi dell’apoptosi. È stato confermato che l’effetto delle Kyn è dovuto all’attivazione di AhR, perchè CYP1A1, un target specifico di AhR, viene indotto dal trattamento. Per spiegare l’effetto di sopravvivenza del trattamento con Kyn è stata analizzata la modulazione delle proteine anti apoptotiche della famiglia di Bcl2. Grazie ad un inibitore di AhR, CH-223191, è stato possibile notare che le Kyn inducono la proteina Mcl1 nelle cellule leucemiche.
I dati ottenuti consentono di annoverare l’asse IDO-Kyn-AhR come una pathway utilizzata dalla cellula di LLC per resistere all’apoptosi ed indicano la strada per una strategia terapeutica volta a interrompere questa via di segnalazione.
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