• Allele-specific
• CRISPR-Cas9
• E.B. Simplex
• Gene editing
• Keratin 14

Epidermolisi Bollosa Simplex comprende un gruppo di malattie genetiche della pelle caratterizzate dalla comparsa di lesioni bollose, localizzate o sparse in tutto corpo, provocate in seguito all’esposizione a stress meccanico anche lieve. Questa fragilità, che colpisce la parte superficiale della pelle, è dovuta a uno scollamento non fisiologico tra i cheratinociti epidermici proliferanti, come risultato di mutazioni nei geni codificanti le cheratine dello strato basale, come la cheratina 14. Questa patologia è di gran lunga la forma più comune di Epidermolisi Bollosa ereditaria e, nonostante si presenti con un fenotipo generalmente leggero, viene comunque percepita come una condizione grave e debilitante, che porta a una scarsa qualità della vita. Per cui, l’identificazione di approcci terapeutici promettenti potrebbe sollevare speranze per lo sviluppo in futuro di trattamenti a lungo termine che portino beneficio a un gran numero di pazienti nel mondo.
Data l’alta prevalenza di forme dominanti, abbiamo delineato una strategia di gene editing allele-specifica su cellule primarie umane di Epidermolisi Bollosa Simplex, caratterizzate da una delezione monoallelica di 21 nucleotidi nell’esone1 del gene KRT14. Questo approccio in vitro è stato attuato attraverso il sistema CRISPR-Cas9, programmato con un RNA guida accuratamente disegnato.
Il lavoro della mia tesi mira a inattivare esclusivamente l’allele mutato, sfruttando l’attività nucleasica di CRISPR-Cas9 per indurre rotture a doppio filamento nel DNA genomico, che successivamente stimolino i meccanismi di riparo della cellula, tra cui quello di ricombinazione non omologa. Piccole inserzioni o delezioni introdotte da questo sistema di riparo del DNA generano mutazioni frameshift che portano all’abolizione dell’espressione dell’allele patogeno. Di seguito mostriamo come la nostra strategia di gene editing abbia avuto successo nel sopprimere l’espressione del gene KRT14 difettivo, permettendo il pieno ripristino del normale fenotipo cellulare, dovuto alla presenza dell’allele wild-type. È da sottolineare, inoltre, come la notevole efficacia e specificità allelica siano associate anche a un buon profilo di sicurezza, valutato tramite un’analisi in silico degli off targets.
In conclusione, i risultati incoraggianti realizzati tramite questo approccio pongono le basi per sviluppi futuri, mirati a ulteriori ottimizzazioni, per una eventuale prossima applicazione clinica.

Epidermolysis Bullosa Simplex (EBS) is a genetic disorder of the skin characterized by either localized or widespread intra-epidermal blistering triggered upon minor mechanical stress. Superficial skin fragility is due to non-physiological splitting within proliferating epidermal keratinocytes, caused by mutations in genes encoding for basal-layer keratins, such as keratin 14. This disease represents by far the most common form of inherited Epidermolysis Bullosa, and despite its generally mild phenotype, it is still perceived as a burdensome and debilitating condition, with a rather poor quality of life. Hence, the identification of a promising therapeutic approach may raise hopes for a future long lasting treatment, which would potentially benefit a great number of patients worldwide. Given the prevalence of dominant forms, we outlined an allele-specific gene editing strategy on human primary EBS cells, carrying a monoallelic 21 base pair deletion on exon1 of KRT14 gene. This in vitro approach was performed through the powerful Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) protein 9 system programmed with an accurately designed single guide RNA (gRNA). The aim of my thesis was to specifically inactivate the mutant allele using CRISPR/Cas9 nuclease activity to induce DNA double strand breaks (DSBs), which subsequently stimulate cell repair mechanisms, including non-homologous end joining (NHEJ). Small insertions and deletions introduced by NHEJ DNA repair system would hopefully generate frameshift mutations resulting in pathogenic allele expression abolishment. Here we show how our gene editing strategy succeeded in suppressing the defective KRT14 expression, thus allowing the full restoration of the normal cellular phenotype, by virtue of the presence of the wild-type counterpart. Notably, the high efficacy and allele-specificity observed was further associated to a promisingly good safety profile, assessed by off target in silico analysis. In conclusion, the encouraging results achieved by this approach lay the foundation for future developments, aiming at its fine tuning and optimization, for a possible forthcoming clinical application.