Riassunto analitico
La cecità totale bilaterale è una grave patologia che colpisce la superficie oculare e consiste in una completa perdita delle cellule staminali limbari in entrambi gli occhi. Queste cellule negli occhi sani sono localizzate nel limbus e consentono il mantenimento e la continua rigenerazione della cornea. Per riparare questi occhi danneggiati sono stati messi a punto molti approcci, e tra i numerosi tentativi il più promettente sembra essere il trapianto autologo di cellule coltivate di mucosa orale (COMET) sopra la superficie oculare ; i primi dati preliminari hanno mostrato che questa sembra essere una terapia praticabile, e gli occhi trattati hanno mostrato un riottenimento dell’ integrità dell’epitelio.
Ciò che non è chiaro ad oggi è se vi sia un completo attecchimento dell’epitelio della mucosa orale sopra la superficie oculare o se vi sia una stimolazione di qualche residua cellula staminale residente, che potrebbe avere bisogno della ricostituzione di un adeguato microambiente per essere attivata e proliferare, consentendo il ripopolamento della cornea.
Questo lavoro di tesi si è focalizzato nella ricerca di marcatori molecolari in grado di distinguere l’epitelio della mucosa orale umana dagli epiteli di cornea e congiuntiva, con lo scopo di discernere fra le due ipotesi e consentire appropriate analisi di follow-up dopo il trapianto. Capire il meccanismo di azione coinvolto in questa terapia è fondamentale per definire una accurata selezione dei pazienti.
Nei precedenti esperimenti abbiamo analizzato un pannello di citocheratine, ma non abbiamo trovato un marker definitivo specifico per ciascun epitelio, quindi è rimasto il bisogno di trovare markers più appropriati.
Prima di tutto è stata condotta un’analisi di microarray dei campioni (cellule progenitrici) di mucosa orale, limbus e congiuntiva per indagare la loro espressione genica e trovare eventuali marcatori differenzialmente espressi; in particolare sono stati scelti tre markers molecolari per la loro significativa up-regolazione o down-regolazione nei rispettivi tre epiteli. Questi dati di microarray sono stati poi validati grazie ad analisi di Real Time-PCR, e la relativa espressione proteica è stata analizzata con tecniche di immunofluorescenza, che sono state messe a punto sia in condizioni in vivo che ex vivo, così come attraverso analisi di western blot e analisi di immunoistochimica. Abbiamo selezionato i marcatori SOX2 e PITX2 per l’epitelio della mucosa orale, mentre PAX6 per gli epiteli di cornea e congiuntiva. L’espressione di questi fattori di trascrizione differenzialmente espressi, così come quella di alcune citocheratine, è poi successivamente stata osservata mediante analisi di immunoistochimica effettuate su un campione derivato da un paziente che aveva precedentemente sostenuto il trapianto di mucosa orale su occhio per il trattamento della cecità totale bilaterale.
I dati ottenuti, sebbene preliminari, hanno mostrato che la superficie oculare in questione esprimeva marcatori molecolari associati all’epitelio della mucosa orale, portando quindi a escludere l’ipotesi di un effetto stimolatorio del tessuto trapiantato e, di contro, suggerendo l’ipotesi di un completo attecchimento e mantenimento dell’epitelio della mucosa orale sopra la superficie oculare.
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Abstract
The total bilateral limbal stem cell deficiency (LSCD) is a severe eye-disease that consists in a complete loss of limbal stem cells in both eyes. In healthy eyes, these cells are located in the limbus and are responsible for corneal maintenance and regeneration.
Many attempts have been explored to restore these damaged eyes. Among a wide panel of approaches, the transplantation of autologous cultured oral mucosal cells (COMET) onto the ocular surface seems to be the most promising, and preliminary data demonstrate that treated eyes result in a nearly-complete restoration of epithelium integrity. It is not clear yet, whether there is a complete engraftment of the oral mucosal epithelium onto the ocular surface or the transplant stimulates any residual limbal stem cells, which may need the restoration of an appropriate microenvironment to be activated and proliferate, to allow the repopulation of the cornea.
This project focused on the research of molecular markers able to distinguish the oral mucosal epithelium from the corneal and conjunctival epithelia, with the final aim of distinguishing between the two hypothesis and perform appropriate follow-up analysis after the transplant. To understand the mode of action of this therapy is critical for the definition of an appropriate selection of patients.
In previous experiments we analysed a panel of cytokeratins, but we did not find a definitive marker specific for each epithelium, hence the need for appropriate markers remained. First of all, a microarray analysis of oral mucosal, limbal and conjunctival progenitor cells was performed in order to find potential markers, differentially expressed; as a result three molecular markers were chosen for their significant upregulation or downregulation among these three epithelia. These microarray data were than validated by means of Real Time-PCR and the relative proteins expressions were further confirmed by immunofluorescence analyses, both in in vivo and ex vivo samples, as well as by western blot and immunohistochemical analyses.
We selected SOX2 and PITX2 markers for the oral mucosal epithelium, and PAX6 for corneal and conjunctival epithelia. The presence of these differentially expressed markers, as well as some cytokeratins, was than confirmed by means of immunohistochemistry analyses in a sample derived from a patient who underwent a previous autologous oral mucosal transplantation onto the ocular surface, for the treatment of total bilateral LSCD. Preliminary data revealed that this ocular surface expressed molecular markers associated to the oral mucosal epithelium, thus excluding the hypothesis of a stimulatory effect of the transplanted tissue, instead suggesting the engraftment and maintenance of oral mucosa epithelium on the corneal surface.
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