Riassunto analitico
I recettori Sigma, inizialmente classificati come appartenenti alla classe dei recettori degli oppioidi, sono oggi riconosciuti come una classe a se stante, suddivisa in due sottotipi, sigma-1 e sigma-2. Tra i numerosi recettori descritti farmacologicamente durante il XX secolo, quasi tutti sono stati clonati alla fine degli anni '90, incluso il recettore sigma-1. Il recettore sigma-2 ha rappresentato una delle poche eccezioni, tanto da essere definito recettore enigmatico. Questa proteina è attualmente oggetto di un rinnovato interesse in quanto si è dimostrata essere coinvolta in numerose patologie neurodegenerative come la schizofrenia, il morbo di Alzheimer e il cancro. Recentemente (3 luglio 2017), utilizzando un approccio di tipo biochimico, un team statunitense, ha identificato il recettore sigma-2 come TMEM97, una proteina trans membrana presente nel reticolo endoplasmatico. La scoperta dell'identità molecolare del recettore sigma-2 ha permesso di includere questo bersaglio molecolare nell'era moderna del drug discovery, consentendo strategie più efficaci per la progettazione mirata di nuovi farmaci.
Il mio progetto di tesi sperimentale, inserito all'interno del progetto FAR, si è svolto in due fasi distinte, ciascuna con obiettivi specifici. La prima parte si è focalizzata sulla clonazione e purificazione del recettore sigma-2. Ad oggi, nessun gruppo di ricerca ha ancora pubblicato la struttura cristallografica di questa proteina. Tuttavia, la conoscenza della sua struttura tridimensionale è il punto di partenza necessario per la progettazione razionale di nuovi ligandi, attraverso il classico approccio di structure-based drug design . Usando il sistema di espressione Bac to Bac abbiamo espresso il gene TMEM97. Il gene TMEM97 è stato clonato in un plasmide donatore pFASTBac e il plasmide ricombinante è stato trasformato nelle cellule competenti DH10BAC, contenenti il genoma baculovirale (bacmid) e un plasmide helper. Le colonie contenenti bacmid ricombinante sono state selezionate ed usate per transfettare le cellule di insetto sf9. L'espressione della proteina TMEM97/sigma-2 è stata confermata dall’analisi Western blot.
La mia seconda parte del progetto di tesi ha avuto come obiettivo la comprensione del meccanismo di azione del composto BS148, un potente agonista del recettore sigma-2 che ha mostrato un'attività antiproliferativa selettiva verso la linea cellulare di melanoma maligno metastatico (SK-MEL2), con una tossicità trascurabile nei confronti dei melanociti sani e delle cellule di melanoma primario (SK-MEL28). È noto da letteratura che gli agonisti del recettore sigma-2 sono in grado di uccidere le cellule tumorali, che presentano livelli di espressione del recettore sigma-2 10 volte superiori rispetto alle cellule quiescenti. Questo obiettivo è stato perseguito utilizzando una combinazione di tecniche di microscopia confocale e Western Blot. Il ligando fluorescente BS148 è stato utilizzato per esaminare la presenza del recettore sigma-2 nelle cellule SK-MEL2, SK-MEL28, melanociti, cellule Hela transfettate con pCMV-TMEM97 e una linea cellulare di controllo positiva, MCF7 (cellule tumorali mammarie umane). Le cellule sono state coltivate e trattate con una concentrazione pari a 100 nM di BS148-fluo per 1 e 24 ore, a 37 ° C, e l'intensità di fluorescenza è stata analizzata mediante analisi di microscopia confocale. Le immagini di microscopia confocale hanno mostrato che BS148-fluo si accumula in tutti i tipi di cellule, localizzandosi principalmente nella regione perinucleare e nel citoplasma. Questo risultato avvalora l'idea che il recettore sigma-2 possa rappresentare un bersaglio innovativo per la diagnosi, il monitoraggio e la cura del cancro.
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Abstract
Sigma receptors, initially classified as an additional class of the opioid receptors, are widely recognized as an independent class of receptors, divided into two subtypes, sigma-1 and sigma-2. Almost all of the drugable targets pharmacologically described during the 20th century, were cloned by the end of the 1990s, including receptors sigma-1. A key exception was the receptor sigma-2. This enigmatic protein has attracted significant attention because of its involvement in diverse diseases as schizophrenia, Alzheimer’s disease and cancer. Very recently (July 3, 2017), using a chemical biology approach, a U.S. team, identified the receptor sigma-2 as TMEM97, an endoplasmic reticulum-resident transmembrane protein. The disclosure of the molecular identity of the sigma-2 receptor brought this target protein into the modern age of drug discovery, enabling more effective strategies for drug design.
Within a FAR project, my master’s degree was organized into two phases with specific objectives. The first part of my project was focused on the cloning and purification the sigma-2 receptor. The still unknown 3D crystal structure of this receptor is an essential key point for the design of valuable sigma ligands, through a structure-based drug design approach. The TMEM97 gene was cloned into a pFASTBac donor plasmid, using the Bac to Bac expression system and the recombinant plasmid was transformed into DH10BAC competent cells, containing the baculoviral genome (bacmid) and a plasmid helper. Colonies containing the recombinant bacmid were selected and used to transfect sf9 insect cells. The expression of the TMEM97 / sigma-2 protein was confirmed by Western blot analysis.
My second part of the project was focused on the understanding of the mechanism of action of BS148, a potent sigma-2 receptor agonist, showing a selective anti-proliferative activity towards a metastatic malignant melanoma cell line (SK-MEL2), with almost no toxicity for normal human melanocytes and primary melanoma cells (SK-MEL28). It is known that sigma-2 receptor agonists are able to kill tumor cells, which present sigma-2 receptor in a 10-fold higher density compared to quiescent cells. This goal was achieved using a combination of imaging and western blotting analysis. The fluorescent BS148 sigma-2 selective ligand was used as a molecular tool to probe the presence of the sigma-2 receptor in SK-MEL2, SK-MEL28, Melanocytes, Hela cells transfected with pCMV-TMEM97 and a positive control cell line, MCF7 ( human breast tumor cells). Cells were grown to subconfluence and treated with BS148-fluo (100 nM) for 1 and 24h, at 37°C, and the fluorescent intensity was analyzed by confocal microscopy analysis. The confocal microscopy images showed that BS148-fluo accumulates in all cell types, localizing mostly in the perinuclear region and in the cytoplasm. This result supports the idea that sigma-2 receptor is an innovative target in cancer, paving the way for improved tools for cancer diagnosis, monitoring and therapy.
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