Riassunto analitico
Lo scopo di questo progetto è la ricostruzione e la caratterizzazione di un’emicornea (stroma e epitelio corneale), seminando cellule primarie umane su un scaffold biocompatibile e innovativo. E’ stato dimostrato che l’organizzazione dello stroma corneale può essere riprodotta utilizzando un campo magnetico per allineare le fibre di collagene e ricostruire gli strati ortogonali. Ciò ha permesso la ricostruzione in vitro di un emicornea umana colonizzata con cheratociti primari e cellule epiteliali limbari derivate dalla cornea umana formando cosi un epitelio ben differenziato, come dimostrato da analisi istologiche, ultrastrutturali e dall'espressione di marcatori specifici. Tuttavia, questa emicornea ha mostrato una scarsa resistenza biomeccanica. Perciò è stato studiato un approccio per la ricostruzione di un’emicornea, con l'obiettivo di un’applicazione clinica, per sostituire la cornea patologica. Cheratinociti limbari e cheratociti stromali sono stati isolati da cornea umana. Cheratociti stromali sono stati coltivati utilizzando diversi mezzi di coltura cellulare per ottimizzare la loro crescita e rallentare la loro differenziazione in vitro. E’ stata studiata l'identità delle cellule mediante immunofluorescenza per poter valutare la natura dei cheratociti e la presenza di contaminanti cellulari. E’ stata analizzata l'espressione del CD34, come marker dei cheratociti indifferenziati alfa-SMA, marker di transizione miofibroblastico, e infine le citocheratine 3, 12, 13 marcatori del differenziamento dell’epitelio corneale. Sono riportati gli studi affinché lo scaffold biologico abbia una significativa resistenza biomeccanica ed una elevata trasparenza neccessaria per la ricostruzione corneale. E’ stato quindi sterilizzato con approcci diversi e analizzato per valutare le proprietà biomeccaniche e la capacità di interagire con le cellule. Si è osservato che in entrambi i casi di sterilizzazione c’era una scarsa adesione cellulare. Dato che la rigidità e la flessibilità della superficie dove crescono le cellule può influenzare l’adesione, il differenziamento e il comportamento delle cellule si è deciso di studiare e analizzare la rigidita dello scaffold. E’ stato fatto un confronto dello scaffold con la fibrina, che è il supporto utilizzato per il trapianto clinico delle cellule corneali su pazienti con una carenza totale di cellule staminali limbari. La matrice di fibrina è il supporto meccanico ideale, poiché non influisce sulla crescita delle cellule, è facile da maneggiare e garantisce la staminalità delle colture cellulari. Per studiare come la rigidità possa influenzare l'adesione e il comportamento delle cellule, è stata generata una fibrina a diverse rigidità. Sono stati seminati i cheratinociti umani sulle diverse fibrine: standard, rigida e morbida e pertanto sono state indagate l'adesione cellulare, la proliferazione e il mantenimento delle cellule staminali. I risultati mostrano che la fibrina con diverse rigidità può preservare l'adesione, la proliferazione, la staminalità e il comportamento delle cellule sono comparabili. Infine, la plastica utilizzata per le colture cellulari è stata utilizzata come termine di paragone essendo più rigida rispetto allo scaffold. Le analisi di confronto riconfermano che la rigidità studiata nel nostro caso non esercita un effetto rilevabile sul comportamento delle nostre cellule. La fase successiva del progetto, comprende lo studio delle vie coinvolte nel sistema di meccanotransduzione e la modifica della rigidità dello scaffold in grado di modulare il comportamento cellulare. Inoltre i cheratociti stromali e le cellule staminali limbari dopo essere coltivati sullo scaffold verrano valutati per confermare l'idoneità delle condizioni di coltura selezionate.
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Abstract
The aim of this project is the reconstruction and characterization of an hemicornea (i.e. epithelialized stroma), seeding primary human cells on a biocompatible scaffold.We recently showed that the highly organized architecture of corneal stromal could be reproduced using a scaffold consisting of orthogonally aligned multi layers of collagen fibrils assembled in a high magnetic field. Such scaffold allowed the in vitro reconstruction of an human hemicornea, by colonization with primary human keratocytes and human limbal epithelial cell derived from limbo-corneal stem cells. On the surface of such construct, a well-differentiated epithelium was formed, as demonstrated by histological and ultrastructural analysis and by the expression of specific markers. Nevertheless, this hemicornea showed poor biomechanical resistance. On this basis, we investigated a new approach to hemicornea manufacturing to improve its properties, with the aim of a future clinical application of an autologous corneal substitute for the treatment of a variety of pathologic conditions. Limbal keratinocytes and stromal keratocytes were isolated from whole human corneas. Stromal keratocytes were cultured using different cell culture media to optimize their growth and slacken their differentiation in vitro. We investigated the cell identity by immunofluorescence and the cell purity by evaluation of the presence of cell contaminants in culture. We analysed the expression of CD34, as a marker of non-differentiating keratocytes, of alpha-SMA as marker of myofibroblastic transition and finally, cytokeratin 3,12,13 as corneal epithelial differentiation markers. Here we present the most recent studies on a novel biological scaffold with a significant biomechanical strength and very high transparency, as a candidate for corneal reconstruction. The selected scaffold was sterilized with different approaches and analyzed for maintainance of biomechanical properties and capability to interact with cells. Both high pressure saturated vapour and different amount of gamma rays administration leads to poor cell adhesion. Since extracellular environment can modulate biophysical and biochemical signalling, influencing cellular adhesion and phenotype, the effects of scaffold stiffness and cell adhesion were investigated. Afterwards, we compared scaffold stiffness with fibrin glue, the carrier used for clinical transplantation of cultured corneal cells on patients with total limbal stem cell deficiency, The fibrin matrix is the ideal mechanical support since it doesn’t affect cultured cells and it is easy to handle. In addition, it has adhesive properties and protect the stem and proliferative compartment from mechanical damage . To investigate how stiffness can influence adhesion and cell behaviour, we generated fibrins with different stiffnesses. We seeded primary human keratinocytes on the different fibrin glues : standard, stiff and soft fibrin glue, therefore cell adhesion, proliferation, differentiation and stem cell maintenance, were investigated. Results showed that fibrins with different stiffnesses can preserve adhesion, proliferation, stemness and cell’s behavour with comparable results. Finally, plastic cell culture plate was used as more rigid control, compared to our scaffold. Analysis of comparison confirmed again the absence of stiffness-related effects, in our culture condition. The ongoing step of this study includes the investigation of pathways involved in mechanotransduction system and the selection/modification of scaffold stiffness able to modulate cell behaviour. Both stromal keratocytes and limbal stem cell derived from human epithelium will be evaluated to confirm suitability of selected culture conditions.
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