Riassunto analitico
I tumori primari della trachea sono lesioni neoplastiche rare delle vie respiratorie con prognosi sfavorevole ed alto tasso di mortalità. La resezione chirurgica è considerata il trattamento di scelta, tuttavia, molti pazienti affetti da tumore maligno della trachea non possono essere sottopoti ad intervento chirurgico a causa di un coinvolgimento tracheale superiore al 50%. In questi casi è possibile il solo trattamento transitorio dei sintomi. Evidenze cliniche recenti hanno mostrato che questi pazienti possono essere trattati con il trapianto di un tratto respiratorio umano bioingegnerizzato. Una trachea umana da donatore post-mortem può essere decellularizzata ed utilizzata per generare una trachea umana bioingegnerizzata mediante la colonizzazione del supporto biologico con cellule epiteliali somatiche autologhe espanse in vitro e condrociti derivati da cellule staminali mesenchimali del paziente. Questa trachea umana bioingegnerizzata può essere, quindi, trapiantata per ripristinare la funzione respiratoria in un paziente affetto da patologia respiratoria allo stadio terminale. Valutazioni a lungo termine hanno, tuttavia, mostrato come l'epitelio respiratorio sia essenziale per prevenire infezioni, reazioni fibrotiche e stenosi del tratto respiratorio bioingegnerizzato trapiantato. Lo scopo principale di questo progetto è quello di ottimizzare le condizioni di coltura cellulare per le cellule epiteliali respiratorie umane allo scopo di preservare la popolazione di cellule staminali adulte respiratorie ed il loro potenziale di proliferazione e differenziamento. Per raggiungere questi obiettivi sono stati condotti studi in vitro di caratterizzazione delle cellule epiteliali respiratorie umane e di identificazione delle cellule progenitrici e del loro mantenimento in vitro. E' stato, inoltre, analizzato il differenziamento delle cellule progenitrici in tutti i tipi cellulari della trachea. Due sistemi di coltura cellulare sono stati valutati per la loro capacità di mantenere l'espressione di marcatori epiteliali di staminalità/proliferazione (p63, Bmi1, Ki67), marcatori del differenziamento (14-3-3σ, Involucrin, ZO1) e marcatori delle cellule epiteliali respiratorie (AQ3, CK18, MUC5AC). In presenza di feeder layer e siero fetale bovino, le cellule epiteliali respiratorie umane hanno mostrato livelli maggiori di proliferazione e migrazione, mantenimento dell'epressione dei marcatori delle cellule staminali/progenitrici e differenziamento di un epitelio stratificato e polarizzato. Questa condizione di coltura cellulare è stata, quindi, selezionata per le analisi successive. Le cellule epitheliali tracheali sono state isolate da biopsie umane e coltivate in vitro per diversi passaggi al fine di valutare il loro tasso di crescita, la resa cellulare, la capacità di formare colonie e il loro potenziale proliferativo espresso come il numero totale di duplicazioni cellulari effettuate prima della senescenza. Infine, sono state effettuate analisi a singola cellula per caratterizzare le popolazioni di cellule staminali e di "transient amplifying cells". Le analisi dei cloni hanno rivelato che le cellule epiteliali tracheali umane hanno la capacità di generare i tre tipi clonali oloclone, meroclone e paraclone precedentemente identificati in altri epiteli umani, suggerendo gli olocloni come potenziali cellule staminali dell'epitelio tracheale. Nella condizione di coltura selezionata, le cellule epiteliali respiratorie umane sono in grado di mantenere la popolazione di cellule staminali e differenziare in tutti i tipi cellulari necessari per ripopolare correttamente i supporti naturali o sintetici utilizzati per lo sviluppo di trachee umane bioingegnerizzate destinate al trapianto.
|
Abstract
Primary tracheal tumors are uncommon neoplastic lesions of the airways with poor prognosis and high mortality rate. Surgical resection is considered as the treatment of choice, however, most patients with primary malignant tracheal cancers cannot undergo surgery due to tracheal involvement over 50% and only transitory treatment of symptoms is possible. Recent clinical experiences have shown that these patients can be treated by transplantation of bioengineered human airway tracts. Donor human tracheas can be decellularized and a bioengineered human trachea can be obtained by scaffold colonization with in vitro expanded autologous somatic epithelial cells and chondrocytes derived from mesenchymal stem cell of the patient. This bioengineered human trachea can be, therefore, implanted to restore respiratory function in a patient with end-stage airway disease. However, on long term evaluation, airway epithelium was shown to be essential to prevent infections, fibrotic reactions and stenosis of transplanted bioengineered human respiratory tract.
The overall aim of this project is to optimize cell culture conditions for adult human airway epithelial cells to maintain airway stem cells population and their proliferative and differentiation potential. To achieve these objectives, characterization of human respiratory epithelial cells was performed in vitro, as well as identification of progenitors cells and their in vitro maintenance. Progenitors cells differentiation in all cell types of tracheal tract, was also studied.
Two culture systems were evaluated for their capability to maintain expression of epithelial stemness/proliferation markers (p63, Bmi1, Ki67), differentiation markers (14-3-3σ, Involucrin, ZO1) and airway epithelial cells markers (AQ3, CK18, MUC5AC). In presence of feeder layer and fetal bovine serum, human airway epithelial cells showed higher proliferation and migration levels, maintenance of stem/progenitor cells markers expression and differentiation of a stratified and polarized epithelium. This culture condition was then selected for further analysis.
Tracheal epithelial cells were isolated from human biopsies and cultured in vitro for several passages to evaluate their growth rate, cell yield, colony forming efficiency and proliferative potential measured as the total number of cell doubling before senescence.
Finally, single cell analysis were performed to characterize stem cells and transient amplifying cells populations. Clonal analysis revealed that human tracheal epithelial cells are able to generate the three clonal types holoclone, meroclone and paraclone previously identified in other human epithelia, suggesting the holoclones as the putative stem cells of tracheal epithelium.
In the selected culture condition, human respiratory epithelial cells are able to maintain stem cells population and differentiate in all cells types required to properly re-populate biological or synthetic scaffolds used to develop a bioengineered human trachea for transplantation.
|