Riassunto analitico
I batteri acetici sono noti nell’industria alimentare come organismi alla base della produzione di aceti. La produzione industriale di aceto da vari substrati di acetificazione (vino, sidro, alcol) avviene mediante processi in sommerso. La fermentazione acetica in sistema sommerso è condotta mediante colture indigene di batteri acetici mantenute in coltivazione in cicli di fermentazione ripetuti. Per tali colture è documentata la difficile coltivazione in terreni di coltura, a causa della bassa capacità di dare origine a colonie e della bassa densità cellulare di colture all’interno dei bioreattori. Vista la non facile gestione delle colture acetiche, la gestione dei parametri di processo risulta di fondamentale importanza per favorire gli organismi e i bioprocessi necessari alla produzione.
Un’esigenza dell’industria degli aceti riguarda la conoscenza microbiologica delle colture impiegate, al fine di sfruttare la selezione e lo sviluppo di ceppi batterici per attuare nuove strategie industriali, come la produzione di aceti ad alta acidità. Nel presente lavoro viene affrontato l’impiego dei batteri acetici nella produzione di aceto di alcool in sommerso e si analizzano le variabili che incidono sulla presenza e attività dei batteri acetici in tali processi. L’attività svolta in questo lavoro di tesi si compone di due parti: 1) esperienza presso l'azienda Cetotec GmbH, specializzata in servizi per l'industria dell'aceto; 2) attività sperimentale presso il laboratorio di microbiologia degli Alimenti (UNIMORE). La prima fase dell’attività ha previsto un’esperienza di tre mesi, analizzando due sistemi di produzione di aceto di alcool. Sono stati oggetto di studio due fermentatori pilota in sistema sommerso, l’uno operante in fed-batch e l’altro in semi-batch. Entrambe le varianti, fed-batch e semi-batch, prevedono l’utilizzo di una parte del prodotto fermentato e ricco di cellule batteriche, a fine ciclo, come inoculo per il ciclo successivo. Il sistema in fed-batch consente la produzione di aceto di alcool ad elevata concentrazione di acido acetico (circa 20%) resa possibile grazie alla presenza di una fase intermedia di incremento della concentrazione totale, durante la quale viene dosato alcool concentrato a intermittenza nel fermentatore. Il sistema in semi-batch, invece, prevede un’unica fase iniziale di carico della miscela da acetificare e lo scarico di un prodotto finale a una concentrazione di acido acetico inferiore (circa 15%) rispetto al sistema precedente. Si è seguito l’andamento dei cicli al fine di valutarne la ripetibilità e sono stati monitorati i parametri di produzione (acido acetico, etanolo, temperatura e ossigeno) nei vari cicli al fine di correlare lo sviluppo batterico con le condizioni del mezzo. La seconda parte del lavoro ha riguardato lo studio microbiologico di campioni prelevati dai suddetti acetificatori. L’isolamento è stato condotto impiegando terreni di coltura a differente composizione e lo sviluppo batterico è stato caratterizzato da una crescita molto lenta (circa 15 giorni). I terreni di coltura a fonte di carbonio multipla si sono rivelati più idonei. Infatti è stato possibile condurre test fenotipici che hanno confermato la presenza di batteri acetici. Tuttavia, la crescita stentata è stata un limite per l’allestimento di ulteriori test fenotipici. L’analisi coltura indipendente ha previsto l’estrazione del DNA genomico dai campioni di aceto tal quali. In questo caso è stato possibile ottenere una adeguata quantità e qualità di DNA per lo sviluppo delle analisi molecolari mediante PCR/DGGE. Il presente lavoro di tesi ha permesso di conoscere le modalità di gestione dei fermentatori in sommerso e di attuare uno studio microbiologico delle colture, da cui si evince chiaramente come le condizioni di alta pressione selettiva dei fermentatori siano un limite per lo studio ex situ della popolazione microbica.
|
Abstract
Acetic acid bacteria are known in food industry for their role as bacteria responsible for vinegar production. Industrial vinegar production from different substrates (e.g. wine, sider, ethanol) is carried out by submerged processes. Acetic acid fermentation in submerged system is performed by indigenous acetic acid bacteria cultures propagated by repeated cultivation cycles. These bacterial cultures are known to be difficult to cultivate in media due to low ability to form colonies e low cellular density cultures into bioreactors. Due to the difficult handling of acetic acid bacteria cultures, the management of processes parameters is of great importance to favorite suitable bacteria and conditions. Advances in the study of acetic acid bacteria microflora of submerged processes could be of relevance in the light of existing processes optimization. On the basis of these observations, the research work of this thesis was focused on acetic acid bacteria and variables that affect their activity in submerged alcohol vinegar production. The research activity is composed by two parts: 1) training activity in Cetotec GmbH, specialized in services for the vinegar industry; 2) experimental activity performed at the laboratory of Food Microbiology (UNIMORE). The first part of the activity focused the production of alcohol vinegar. Two pilot systems operating in fed-batch and semi-batch, respectively were analyzed. Both systems are based on the use of a part of the fermented product at high cells concentrations as inoculum of the next cycle. Fed-batch system is operated dosing ethanol intermittently to the aim to increase total concentration (sum of ethanol and acetic acid) gradually. Semi-batch system is carried by a single charge phase and the discharge of the end product at a concentration of about 15% of acetic acid. During the training the processes were followed by monitoring processes parameters (acetic acid, ethanol, temperature, oxygen) along cycles to correlate bacteria growth to media composition. The second parts of the thesis activity focused the microbiological study of samples deriving from the aforementioned bioreactors. Strains isolation was carried out on culture media at different composition and bacteria growth was very slow (for some cultures about 15 days). The highest strain recovery was obtained in culture media at multiple carbon sources (glucose, ethanol, acetic acid). In fact, it was possible to carry out tests confirming the occurrence of acetic acid bacteria. However, the very low growth was a limit for further phenotypic assays. Culture independent analysis was performed by genomic DNA extraction from vinegar samples. In this case it was obtained a suitable genomic DNA for further molecular analysis by PCR/DGGGE. This work allowed to investigate submerged processes for alcohol vinegar production, both regarding processes parameters and acetic acid bacteria microflora. Selective pressure due to stringent conditions into bioreactors was detected as the main limit for the ex situ study of bacterial population.
|
