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La Terapia di Sostituzione Enzimatica (ERT) è uno dei pochi trattamenti disponibili per molte patologie in cui difetti genetici causano un’alterazione nella funzionalità enzimatica, tra cui le Malattie da Accumulo Lisosomiale (LSD). Quando sono somministrati in forma libera, gli enzimi sono però limitati dalla loro suscettibilità alla degradazione, inattivazione nell’ambiente biologico, rapida eliminazione dal circolo ematico, e possibile immunogenicità. Questo rende necessario lo sviluppo di sistemi di veicolazione in grado di proteggere l’enzima, migliorarne l’emivita e ridurre l’attivazione della risposta immunitaria.

Studi precedenti condotti dal gruppo di ricerca Te.Far.T.I. hanno portato all’ottimizzazione di un protocollo di doppia emulsione ed evaporazione del solvente W/O/W (DE) per l’incapsulazione di un enzima modello, la β-Glucosidasi, all’interno di nanoparticelle (NPs) polimeriche di acido poli(lattico-co-glicolico) (PLGA). Tuttavia, il metodo formulativo della DE presenta limiti nella riproducibilità e scalabilità, possibile tossicità e alti costi di produzione.

Questo progetto di tesi si inserisce nel progetto N2ERT (NPs2 for Enzyme Replacement Therapy) in collaborazione con l’Università di Bologna e Chiesi Farmaceutici, il cui scopo è quello di formulare NPs con la tecnica della microfluidica (MF) per la veicolazione di due enzimi impiegati nel trattamento delle LSD. Il lavoro si è focalizzato sull’ottimizzazione di un protocollo MF per l’incapsulazione di enzimi per superare i limiti delle tecniche tradizionali. Durante l’ottimizzazione è stato prima utilizzato β-Glucosidasi come modello, e successivamente Lamzede®, specialità medicinale contenente l’enzima Velmanase α, approvata per il trattamento della LSD α-mannosidosi. Per l’ottimizzazione del protocollo di MF, sono state usate come fase organica PLGA in acetone e come acquosa una soluzione di tensioattivo in Milli-Q in cui è stato solubilizzato anche l’enzima; il Total Flow Rate (TFR) è stato fissato a 10 mL/min mentre il Flow Rate Ratio (FRR) è stato ottimizzato nel range 1:1-1:10 O/W. Successivamente, è stato ottimizzato il rapporto polimero: enzima (10:1 w/w), e la concentrazione e tipo di tensioattivo (PVA/Pluronic® F68), trovando rispettivamente valori ottimali di 1:10 e 3% Pluronic® F68.
Le formulazioni ottenute sono state caratterizzate in dimensioni, indice di polidispersione (PDI) e potenziale Z, risultando comparabili a quelle ottenute con la DE (∽180 nm, PDI<0.3, ∽ -8 mV). Sono stati valutati resa ponderale (WY), efficienza di incapsulazione (EE) e capacità di caricamento (LC), queste ultime tramite HPLC, ottenendo rispettivamente un WY > 80%, una EE del 6% e un LC di ~2% di β-Glucosidasi, anche questi in linea con i valori precedentemente ottenuti in DE. Per incapsulare Velmanase α in forma di Lamzede in DE (controllo) è stato necessario aumentare il volume di fase interna, mentre in MF non si sono rese necessarie variazioni dei parametri. Le formulazioni contenenti Lamzede hanno mostrato valori di size, PDI e contenuto compatibili con i precedenti, confermando la buona riuscita dell’ottimizzazione con valori di incapsulazione paragonabili e buona stabilità alla conservazione.

Questo studio ha dimostrato la possibilità di formulare NPs polimeriche caricate con un enzima, con la tecnica della MF, che permette alta riproducibilità e scalabilità. Ulteriori studi sono in corso per valutare l'impiego di eccipienti per aumentare l’incapsulazione, mentre sarà necessario valutare l’attività enzimatica per poi condurre studi in vitro. In una seconda fase del progetto, i risultati ottenuti in questa tesi verranno implementati associando Velmanase α con l’enzima sfingomielinasi nella stessa formulazione.

Enzyme Replacement Therapy (ERT) is one of the few available treatments for many diseases where genetic defects cause a disruption in enzyme functionality, including Lysosomal Storage Disorders (LSD). However, when administered in their free form, enzymes are limited by their susceptibility to degradation, inactivation in the biological environment, rapid elimination from the bloodstream and potential immunogenicity. This necessitates the development of delivery systems capable of protecting the enzyme, improving its half-life, and reducing immune response activation. Previous studies conducted by the Te.Far.T.I. research group have led to the optimization of a double emulsion and solvent evaporation protocol W/O/W (DE) for the encapsulation of a model enzyme, β-Glucosidase, within polymeric nanoparticle (NPs) of poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA). The formulation method of DE, however, presents limitations in reproducibility and scalability, potential toxicity and high production costs. This thesis project is part of the N2ERT (NPs2 for Enzyme Replacement Therapy) project in collaboration with the University of Bologna and Chiesi Pharmaceuticals, aiming at formulating NPs using microfluidic (MF) techniques for the delivery of two enzymes used in LSD treatment. The work focused on optimizing an MF protocol for enzyme encapsulation to overcome the limitations of traditional techniques. During optimizations β-Glucosidase was first used as a model, followed by Lamzede®, a medicinal product containing the enzyme Velmanase α, approved for α-mannosidosis LSD. For the optimization of the MF protocol, PLGA in acetone was used as the organic phase and an aqueous solution of surfactant in Milli-Q water, in which the enzyme was solubilized, was used as the aqueous phase. The Total Flow Rate (TFR) was fixed at 10 mL/min, while the Flow Rate Ratio (FRR) was optimized in the range of 1:1-1:10 O/W. Subsequently, the polymer:enzyme ratio and the concentration and type of surfactant (PVA/Pluronic® F68) were optimized, finding optimal values of 1:10 and 3% Pluronic® F68, respectively. The formulations obtained were characterized in terms of size, polydispersity index (PDI), and Zeta potential, resulting comparable to those obtained with DE (∽180 nm, PDI <0.3, ∽ -8 mV). Weight Yield (WY), encapsulation efficiency (EE) and loading capacity (LC) were evaluated, the latter two via HPLC, yielding a WY > 80%, an EE of 6%, and an LC of ~2% of β-Glucosidase, also in line with values previously obtained in DE. To encapsulate Velmanase α in the form of Lamzede in DE, it was necessary to increase the internal phase volume, while in MF no changes to the parameters were necessary. Formulations containing Lamzede showed size, PDI and content values compatible with the previous one, confirming the successful optimization with comparable encapsulation values and good stability during storage. This study demonstrated the possibility of formulating polymeric NPs loaded with an enzyme using the MF technique, which allows high reproducibility and scalability. Further studies are ongoing to evaluate the use of excipients to increase encapsulation, while it will be necessary to assess enzymatic activity before conducting in vitro studies. In a second phase of the project, the results obtained in this thesis will be implemented by associating Velmanase α with the sphingomyelinase enzyme in the same formulation.