Riassunto analitico
L’impiego di materiale genico in ambito biomedico è aumentato negli ultimi anni grazie alla possibilità di prevenire e trattare malattie genetiche e non genetiche, quali malattie cardiovascolari, autoimmuni e infettive, come dimostrato dallo sviluppo dei vaccini contro il COVID-19. Al contempo, i requisiti di scalabilità sono aumentati, evidenziando la necessità di ottimizzare nuove tecnologie di produzione.
In questo studio è stata ottimizzata la formulazione, mediante tecnica della microfluidica, di liposomi cationici per il caricamento di un plasmide modello. Sulla base di precedenti ottimizzazioni, alcuni parametri legati alla tecnica sono stati mantenuti costanti, mentre altri legati alla formulazione, quali la quantità di lipide cationico (DOTAP) e di lipide fluorescente (DOPE-Rod) e la composizione della fase acquosa, sono stati ottimizzati. Le formulazioni sono state caratterizzate in termini di dimensioni, distribuzione dimensionale, potenziale zeta, morfologia, intensità di fluorescenza e stabilità dimensionale dopo una settimana di conservazione a 4°C.
L’aumento della quantità di DOTAP non ha influito negativamente su dimensioni e distribuzione dimensionale dei liposomi; tuttavia, ha prodotto un notevole incremento del potenziale zeta. Utilizzando TE buffer come fase acquosa, il potenziale zeta si è ridotto a causa del modificato intorno ionico; ciononostante, i liposomi sono risultati dimensionalmente omogenei. È stata quindi valutata l’aggiunta di diverse quantità di DOPE-Rod, necessaria per la rilevazione del sistema in futuri studi in vitro/vivo. Poiché l’incremento di DOPE-Rod ha portato a destabilizzazione dei liposomi, in fase di caricamento del plasmide ne è stata utilizzata la minima quantità sufficiente per rilevare un segnale significativo. Due modalità di caricamento sono state testate: 1) adsorbimento post-formulazione e 2) caricamento durante la formulazione. Per entrambe l’efficienza di caricamento è stata valutata mediante elettroforesi. Per l’adsorbimento post-formulazione, una soluzione di plasmide è stata aggiunta a liposomi vuoti, in modo da raggiungere una concentrazione finale di plasmide di 5, 10 o 15 µg/mL; non è stato possibile aumentare la quantità di plasmide poiché si è assistito ad un progressivo peggioramento delle caratteristiche chimico-fisiche dei liposomi. Le formulazioni sono state nuovamente allestite diluendo i liposomi ma mantenendo la stessa concentrazione di plasmide (diminuendo, così, il rapporto N:P), oppure diluendo in ugual misura liposomi e plasmide (mantenendo, quindi, lo stesso rapporto N:P ma aumentando il volume a disposizione per la formazione dei complessi). In entrambi i casi non è stato possibile ottenere liposomi complessati con il DNA aventi dimensioni, distribuzione dimensionale ed efficienza di caricamento paragonabili alle formulazioni prodotte direttamente con il plasmide in fase acquosa. In quest’ultimo caso, infatti, il plasmide è stato diluito nella fase acquosa a diverse concentrazioni (5-100 µg/mL), corrispondenti a N:P 25:1-1:1, ed è stato possibile ottenere liposomi dimensionalmente omogenei, stabili alla conservazione a 4°C e in grado di caricare con un’efficienza quasi del 100% anche quantità molto elevate di materiale genico. Queste formulazioni rappresentano un grande vantaggio nell’ambito della terapia genica, in quanto possono ridurre la quantità di lipidi cationici somministrati, spesso tossici, pur mantenendo un alto contenuto di DNA.
Sulla base dei risultati ottenuti, la tossicità e la capacità di trasfezione delle formulazioni più promettenti saranno testate in modelli in vitro, mentre le formulazioni saranno ulteriormente studiate in termini di protezione del materiale genico e ottimizzate per la veicolazione specifica su cellule target.
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Abstract
In recent years genetic material has been increasingly used in the treatment of various diseases. Initially used to only treat genetic disorders, its use is now also expanding to non-genetic diseases, such as cardiovascular, autoimmune, and infectious diseases, as demonstrated with the COVID-19 vaccines.
In this study, the formulation of cationic liposomes was optimized to load genetic material, in particular a model DNA plasmid, using a microfluidic technique. Based on previous optimizations, some technique-related parameters were kept constant while other formulation-related parameters, such as the amount of cationic and fluorescent lipids, and the composition of the aqueous phase, were optimized. All formulations were characterized for size, dimensional distribution, zeta potential, morphology, fluorescent intensity, stability to storage conditions, and DNA loading capacity.
Increasing the amount of cationic lipid in the formulation did not affect the size and size distribution of the liposomes, while it produced a significant increase in zeta potential. By using TE buffer as the aqueous phase, the zeta potential was reduced while still allowing the formation of monodisperse liposomes. Therefore, the addition of different amounts of DOPE-Rhod, necessary for the detection of the system in future in vitro/vivo studies, was evaluated. Increasing the amount of DOPE-Rhod created a destabilization of the vesicles and therefore the minimum amount needed to permit a fluorescent signal and reproducible liposomes was selected. The liposome optimized with microfluidics was then tested for its ability to either bind (post adsorption to the surface) or encapsulate (DNA present during liposome formation) plasmid DNA. The amount of free and loaded DNA was quantified by an electrophoretic band shift assay.
For post-formulation adsorption a solution of plasmid was added to empty liposomes in order to achieve a final plasmid concentration of 5, 10, or 15 µg/mL; it was not possible to increase the amount of plasmid because as the concentration increased, a deterioration in the chemico-physical characteristics of the liposomes was noted. In order to assess the effect of dilution on the correct complexation of the gene material, formulations with 5 and 10 μg/mL were re-assembled, either by diluting the liposomes but maintaining the same plasmid concentration (thus decreasing the N:P ratio), or by equally diluting liposomes and plasmid (thus maintaining the same N:P ratio but increasing the volume available for complex formation). This study showed that it was not possible to obtain liposomes complexed with DNA that had comparable size, dimensional distribution, or loading efficiency with formulations produced directly with the plasmid in the aqueous phase. With the method of adding the plasmid into the aqueous phase, it was possible to load larger amounts of gene material (5-100 µg/mL), corresponding to a wider N:P ratio ranging from 25:1 to 1:1, with almost 100% loading efficiency. The increased amount of DNA loaded still resulted in liposomes of small size that were stable upon storage at 4°C, and retained the loaded DNA over several weeks. These formulations represent a great advantage in the field of gene therapy, as they can facilitate the delivery of therapeutic plasmids with a reduced amount of cationic lipids, which are often toxic, while maintaining a high DNA content.
Based on the results obtained, the toxicity and transfection capacity of the most promising formulations will be tested in in vitro models, while the formulations will be further studied in terms of protection of the gene material and optimized for specific delivery to target cells.
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