Riassunto analitico
Il cancro al polmone è una neoplasia maligna prima causa di morte cancro-correlata e con un tasso di sopravvivenza a cinque anni del 17%. Il fumo di tabacco e lo sviluppo economico ne influenzano significativamente l'incidenza. È classificato in due modelli istologici: carcinoma polmonare a piccole cellule (SCLC) e carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC); l'ultimo è più diffuso, rappresentando l'85% dei casi. Esistono tre tipi principali di NSCLC: adenocarcinoma (AD), che rappresenta il 40% dei casi di NSCLC, carcinoma a cellule squamose (SCC) (25-30%) e carcinoma a grandi cellule (LCC) (10-15%). Questi sottotipi differiscono per tipo di mutazioni e riarrangiamenti. Il trattamento e gli approcci farmacologici nel NSCLC prevedono l'uso di chirurgia, chemioterapia, immunoterapia e, per alcune mutazioni, la target therapy. Purtroppo le mutazioni in KRAS, presenti in circa il 30% dei casi di AD, sono considerate non targettabili, anche se recentemente alcuni inibitori hanno mostrato buoni risultati in trial clinici, ma solo per mutazioni specifiche. Una nuova prospettiva, la "non-oncogene dependency", si basa sulla scoperta che la sopravvivenza di molti tumori dipende da geni non mutati; di conseguenza, le cellule cancerose sono più sensibili delle normali alla loro inibizione. Questo concetto è già applicato nel trattamento di altri tipi di cancro. Tramite un'analisi genomica funzionale integrativa, combinando dati in vitro di “non-oncogene dependency” all'interno di un'ampia raccolta di linee cellulari tumorali, informazioni sulla targettabilità di geni e dati sulle mutazioni, il Laboratorio di ricerca traslazionale (IRCCS, RE, Italia) ha identificato EGLN1 come dipendenza targettabile farmacologicamente nell'AD mutato in KRAS. EGLN1 è una prolil-idrossilasi che regola la stabilità di HIF1α in risposta ai livelli di O2. L’oncogenicità di EGLN1 è oggetto di dibattito. Inibitori come il molidustat sono in fase di sviluppo per il trattamento dell'anemia e sono facilmente trasferibili in ambito oncologico. Questa tesi ha lo scopo di convalidare l'attività pro-oncogenica di EGLN1 nell'AD polmonare con mutazione in KRAS. Innanzitutto, abbiamo dimostrato che EGLN1 è più espresso nel tumore rispetto al tessuto sano, attraverso qRT-PCR eseguita sui campioni di pazienti. Quindi, abbiamo eseguito il KO di EGLN1 attraverso CRISPR/Cas9 in due linee cellulari di AD con mutazioni KRAS, NCI-H23 e A549. Un competition assay dimostra che il KO di EGLN1 causa una minor proliferazione, convalidandolo come “non-oncogene dependency” nelle cellule di AD mutate in KRAS. Ci siamo chiesti se molidustat potesse ridurre la proliferazione cellulare e così è stato, dimostrando che EGLN1 è farmacologicamente targettabile nelle NCI-H23 e A549. Poi è stato esplorato il meccanismo molecolare alla base di questa dipendenza; l'analisi di regressione lineare sui dati di dipendenza DepMap mostra che EGLN1 correla negativamente con HIF1α. Il trattamento con molidustat o il KO di EGLN1 induce la stabilizzazione di HIF1α, suggerendone un ruolo nella ridotta proliferazione osservata nelle cellule EGLN1 KO. Successivamente, un competition assay eseguito utilizzando sgRNA mirati a EGLN1, HIF1α o entrambi, dimostra che la sensibilità al KO di EGLN1 dipende solo in parte da HIF1α; perciò altri bersagli di EGLN1 potrebbero essere implicati. Integrando dati di letteratura, di BioGRID e analisi su DepMap, sono emerse 5 co-dipendenze statisticamente significative: ARNT, BRD4, SNUPN, PEX19, MTG16. Forse esiste un meccanismo indipendente da HIF che spiega il ruolo pro-oncogenico di EGLN1 ma ulteriori dati sono necessari. Questi risultati supportano il ruolo pro-oncogenico di EGLN1 e la sua inibizione come potenziale nuova terapia per i pazienti con cancro del polmone.
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Abstract
Lung cancer is a malignant neoplasia and the first cause of cancer-related human death with a five-year survival rate of 17%. Tobacco smoking rates and economic development significantly influence lung cancer incidence. It’s classified in two histological patterns: small cell-lung cancer (SCLC) and non-small cell lung cancer (NSCLC); the last one is more prevalent, representing 85% of cases. There are three main type of NSCLC: adenocarcinoma (AD), representing 40% of NSCLC cases, squamous cell carcinoma (SCC) (25-30%) and large cell carcinoma (LCC) (10-15%). These subtypes differ from each other for type of somatic mutations and rearrangements. Treatment and pharmacological approaches in NSCLC involve the use of surgery, chemotherapy, immune therapy and some mutations can be targeted with target therapy. Unfortunately KRAS mutations, occurring in about 30% of AD cases, are considered undruggable. Recently, small molecule inhibitors have shown promising results in clinical trials, but they target only specific mutations. An innovative perspective is the notion of “non-oncogene addiction”, which is based on the finding that many cancer types depend for their survival on non-mutated genes; as a consequence, cancer cells are more sensitive than normal cells to inhibition of those non-oncogenes, and successful applications of this concept are used in the treatment of other types of cancer.
Using an integrative functional genomic analysis, combining in vitro non-oncogene dependency data within a large collection of cancer cell lines, gene druggability information, and mutation data, the Laboratory of Translational Research (IRCCS, RE, Italy) has identified EGLN1 as a novel druggable dependency in KRAS-mutated AD. EGLN1 is a prolyl hydroxylase which regulates HIF1α subunit stability in response to O2 concentration. The role of EGLN1 in tumor development is still controversial. Inhibitors, like molidustat, are under development for anemia treatment and are easily transferrable into the oncology setting.
This thesis was aimed to validate EGLN1 pro-oncogenic activity in KRAS-mutated lung AD. First, we showed that EGLN1 is more expressed in tumor than healthy tissue, through qRT-PCR performed on patient’s specimens. Then, we performed the KO of EGLN1 through CRISPR/Cas9 in two KRAS-mutated AD cell lines, NCI-H23 and A549. Next, a competition assay shows that EGLN1 KO caused a proliferation impairment, thus validating its role as a non-oncogene dependency in AD cells that harbour KRAS mutation. We investigated if molidustat could reduce cell proliferation; it showed efficacy in reducing cell proliferation, proving that EGLN1 is pharmacologically targetable in NCI-H23 and A549 cells. Next, we explored the molecular mechanism of EGLN1 dependency; EGLN1 dependency negatively correlated with dependency on HIF1α, through linear regression analysis on DepMap dependency data. EGLN1 KO or molidustat treatment induced HIF1α stabilization, suggesting its involvement in the proliferation impairment observed in EGLN1 KO cells. To verify this hypothesis, we performed a competition assay using sgRNAs targeting EGLN1, HIF1α or both; it demonstrated that sensitivity to EGLN1 KO is only partially dependent on HIF1α stabilization. These results have led us to hypothesize that other EGLN1 targets could be implicated. Integrating literature data, BioGRID data, and DepMap analysis, we found 5 statistically significative co-dependencies: ARNT, BRD4, SNUPN, PEX19, MTG16. Probably exists an HIF-independent mechanisms explaining EGLN1 pro-oncogenic role. Further investigation is required to clarify their role.
Our results support the pro-oncogenic role of EGLN1 and its pharmacological inhibition as a potential novel therapeutic strategy for lung cancer patients.
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