Riassunto analitico
La frazione lattica coinvolta nella produzione del formaggio Parmigiano Reggiano (PR) è una popolazione complessa che cambia in funzione della qualità del latte impiegato e ed evolve nel tempo in funzione dei parametri estrinseci di produzione. Nella prima fase i batteri lattici starter (SLAB) termofili contenuti nel siero innesto sono responsabili dell’acidificazione lattica. Nelle fasi successive prevalgono invece i batteri lattici non starter (NSLAB) mesofili originari del latte crudo, i quali contribuiscono al processo di stagionatura e conferiscono al formaggio le sue particolari caratteristiche organolettiche e biofunzionali. In particolare, durante la stagionatura, NSLAB possono rilasciare peptidi bioattivi di cui è documentata un’attività biologica, in particolare di inattivazione dell’enzime ACE (enzima di conversione dell’angiotensina) e DPP-IV (dipeptidil peptidasi IV), la cui inibizione è sfruttata, rispettivamente, nella cura di ipertensione e diabete di tipo II. Nel presente studio sono state analizzate le frazioni lattiche coltivabili, le frazioni peptidiche e le attività biologiche associate nel siero innesto e nel formaggio PR a diversi stadi di stagionatura (12, 18, 24 e 30 mesi) provenienti da tre caseifici nella provincia di Reggio Emilia, allo scopo di stabilire relazioni fra le dinamiche microbiche e l’evoluzione peptidica e delle attività biologiche in funzione del tempo di stagionatura. Sono stati impiegati 3 diversi terreni di coltura (MRS, M17 e M17-SSW), a due temperature di incubazione (37°C e 42°C), parte in aerobiosi e parte in anaerobiosi. Questo ha permesso di isolare un totale di 298 ceppi, di cui 75 SLAB da siero e 223 NSLAB da formaggio. I ceppi SLAB sono stati identificati mediante analisi multiplex PCR dei geni: lacZ, per Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus; antiporto arginina-ornitina per Limosilactobacillus fermentum; dppE, per Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis; prtH, per Lactobacillus helveticus. Sono state svolte anche analisi 16S-ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction) con gli enzimi EcoRI, HhaI e Tru1I. Dei 75 ceppi SLAB, il 26,6% appartiene alla specie S. thermophilus, il 25,3% alla specie L. helveticus, il 22,6% alla specie L. delbrueckii subsp. bulgaricus ed il 14.7% alla specie L. delbrueckii subsp. lactis. I ceppi NSLAB sono stati identificati mediante saggi MutL-PCR e PCR specie-specifiche con primer disegnati su regioni polimorfiche del gene 16S rRNA.In particolare, quest’ultima PCR è stata svolta anche su tutti i NSLAB presunti Lacticaseibacillus casei utilizzando primer specifici per la sottospecie Lacticaseibacillus zeae. Il 46,2% degli isolati appartiene alla specie Lacticaseibacillus paracasei, il 29,6% alla specie L. casei (di cui il 27,3% ha mostrato positività per la sottospecie L. zeae) ed il 17% alla specie Lacticaseibacillus rhamnosus. La distribuzione delle specie varia in base al caseificio di campionamento ed in funzione della stagionatura, con L. paracasei predominante nei campioni più invecchiati. Su tutti gli isolati è stata svolta una (GTG)5-based REP-PCR fingerprinting. Di 17 ceppi rappresentativi tra SLAB e NSLAB l’attribuzione di specie è stata confermata mediante sequenziamento del gene 16S rRNA. Le analisi preliminari della frazione peptidica hanno mostrato differenti capacità di inibizione per gli enzimi ACE e DPP-IV. La frazione peptidica mostra una bassa attività ACE-inibitoria costante nelle varie stagionature, mentre esercita una buona azione inibitoria dell’enzima DPP-IV h che diminuisce all’aumentare dei mesi di stagionatura del formaggio. Il presente studio contribuisce ad approfondire le conoscenze sulle relazioni fra dinamiche microbiche e composizione peptidica in funzione della stagionatura, evidenziando come le attività biologiche associate possono variare nel tempo.
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Abstract
The lactic acid bacteria (LAB) involved in the production of Parmigiano Reggiano cheese (PR) represent a complex microbial system that changes according to the employed milk quality and evolves over time depending on external production parameters. In the first phase, thermophilic starter LAB (SLAB) contained in natural whey are responsible for milk lactic acidification. In subsequent phases, mesophilic non-starter LAB (NSLAB), probably native to raw milk, contribute to the ripening process, conferring peculiar organoleptic and functional features to the final product. During ripening, NSLAB can release bioactive peptides (BP) with a documented inhibitory activity towards the enzymes ACE (angiotensin-converting enzyme) and DPP-IV (dipeptidyl peptidase-4), resulting in antihypertensive and antidiabetic effects, respectively. In the present study we have analysed the cultivable LAB fractions, the peptide fractions and the biological activities associated with natural whey starter and PR cheese samples collected at different ripening stages, namely after 12, 18, 24, 30 months of ripening, from three dairy farms in the province of Reggio Emilia (Italy). The purpose was to establish relations between microbial dynamics, peptide evolution and biological activities as a function of ripening time. An experimental design including three different culture media (MRS, M17 and M17-SSW) at two incubation temperatures (37°C e 42°C) has been carried out under aerobiosis and anaerobiosis conditions. A total of 298 strains were isolated, of which 75 were SLAB from natural whey starter and 223 were NSLAB from PR cheeses. SLAB strains have been identified with multiplex PCR analysis of genes: lacZ, for Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus; arginine-ornithine antiporter for Limosilactobacillus fermentum; dppE, for Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis; prtH, for Lactobacillus helveticus. If needed, they have also been identified through 16S-ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction) analysis with enzymes EcoRI, HhaI e Tru1I. Of the 75 SLAB strains, 26.6% belonged to the species S. thermophilus, 25.3% to the species L. helveticus, 22.6% to the species L. delbrueckii subsp. bulgaricus and 14.7% to the species L. delbrueckii subsp. lactis. Contrarily to previous studies, no L. fermentum has been scored. NSLAB strains have been identified through MutL gene-targeting PCR and, when required, by species-specific PCR assay with primers designed on polymorphic regions of the 16S rRNA gene. In particular, this last PCR analysis were used to solve questionable results from mutL gene-targeting PCR assays in order to presumptive Lacticaseibacillus casei from the subspecies Lacticaseibacillus zeae. Of the isolates, 46.2% belonged to the species Lacticaseibacillus paracasei, 29.6% to the species L. casei (27.3% of which shown positivity for the subspecies L. zeae) and 17% to the species Lacticaseibacillus rhamnosus. The species distribution proved to be dairy farm- and ripening-dependent, with L. paracasei prevailing over ripening time. All the isolates were submitted to (GTG)5-based REP-PCR fingerprinting analysis. For seventeen representative strains, species attribution was also confirmed with 16S rRNA gene sequencing. The preliminary analysis of the peptide fraction showed that ACE-inhibition activity was generally low and constant over ripening time, while DPP-IV-inhibition activity was high in cheese samples with low ripening time and then decreased during ripening. The present study contributes to establish relationships between microbial dynamics and peptide composition in function of ripening time, underlining how associated biological activities can change over time.
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