• Genome editing
• Isoforms
• Photoreceptors
• PKGs
• Retinitis pigmentosa

La retinite pigmentosa è una malattia rara, a base genetica caratterizzata dalla degenerazione e morte dei fotorecettori. Questo processo inevitabilmente determina una progressiva perdita della vista nei soggetti coinvolti. La via del cGMP si ipotizza possa avere un ruolo importante nella degenerazione dei fotorecettori della retina, perché l’accumulo del cGMP sembrerebbe attivare una cascata di eventi che culminano con la morte cellulare dei fotorecettori. Per questo motivo vari studi si stanno concentrando sui target del cGMP per rallentare la degenerazione retinica ed evitare la perdita di coni e bastoncelli.
Il cGMP è un secondo messaggero e tra i suoi vari target ci sono le proteina chinasi G (PKG). Le PKG sono proteine ad attività serina-treonina chinasica, sono presenti in molti distretti corporei, compreso il sistema nervoso centrale, e fanno parte della pathway del cGMP. Queste chinasi agiscono come dimeri e per essere attivate necessitano di essere legate da due molecole di cGMP per ogni monomero.
Esistono tre isoforme di PKG: PKGIα, PKGIβ e PKGII. Nella retina entrambe le isoforme di PKGI sono maggiormente espresse rispetto alla PKGII e, nello specifico, sembra che l’isoforma più espressa sia la PKGIβ. Per questo motivo in questo progetto ci siamo focalizzati sulla caratterizzazione del coinvolgimento di PKGIα e PKGIβ nella degenerazione dei fotorecettori. Gli enzimi PKGI α e PKGIβ sono codificati dallo stesso gene e differiscono solo per il primo esone, cioè differiscono per i primi 100 amminoacidi a livello proteico. È quindi molto difficile investigare il ruolo specifico delle singole isoforme nella patologia ed è molto complesso anche targettare le due isoforme in modo differenziale.
In questo progetto di tesi si è cercato di affrontare questo problema sfruttando la capacità del sistema CRISPR/CAS9 di editare un sito specifico nel genoma. Sono state progettate due RNA guida (gRNA): un gRNA specifico per l’isoforma PKGIα e un secondo gRNA per la PKGIβ. Queste sequenze oligonucleotidiche guidano l’endonucleasi CAS9 nel sito target adiacente alla sequenza PAM (5’-NGG-3’). Questo enzima determina un taglio a doppio filamento subito dopo la sequenza PAM. La risposta di riparo al DNA basata su NHEJ (non-homologous end joining) genera casualmente in alcune cellule una mutazione e quindi un KO dell’isoforma d’interesse.
Al fine di editare le due isoforme di PKGI in cellule di fotorecettori, i due gRNA progettati sono stati clonati nel plasmide PX459 contenete la cassetta di espressione della CAS9. I due plasmidi sono stati trasfettati in una linea cellulare di fotorecettori murini, 661W. Queste cellule sono precursori dei fotorecettori immortalizzati in coltura ed esprimono geni specifici dei bastoncelli. Mediante il test con T7 endonucleasi I sulle cellule trattate abbiamo riscontrato che l’editing genomico è avvenuto con efficienza maggiore nelle cellule in cui era stata traghettata l’isoforma PKG1β; isoforma più espressa a livello retinico.
L’obiettivo generale di questo progetto è generare un nuovo modello di studio della via del cGMP in cellule in cui è presente soltanto una singola isoforma di PKGI. Questo nuovo modello in vitro sarà utile per definire il ruolo delle singole isoforme nella patologia e per validare i bersagli di nuovi farmaci. Nello specifico verranno testati i bersagli molecolari del farmaco LP-CN03. LP-CN03 è un analogo del cGMP con attività inibitoria. Tra tutti i farmaci di questo tipo sembra essere il più efficace nell’inibire gli effettori della via del cGMP risultando promettente per il trattamento della patologia. Un modello di questo tipo potrà quindi favorire la scoperta di nuovi meccanismi patogenetici e lo sviluppo di nuove terapie per contrastare la retinite pigmentosa.

Retinitis Pigmentosa is a rare genetic disease characterized by photoreceptor degeneration and cell death. This process inevitably leads to the completely lost of the sight. The cGMP pathway is likely involved in the degeneration of rods and cones in the retina, because the increased levels of cGMP in these cells activates a pathway that leads to cell death. This is why lots of studies are focusing on targeting cGMP to slow down degeneration and treat the disease. cGMP is a secondary messenger with lots of target, among which protein kinase G (PKG) can be identified. PKGs are serine-threonine kinase acting as dimers. They are present in different tissues and organs in the body as the central nervous system, where they take part in the cGMP pathway when two molecules of cGMP bind a monomer of PKG and activate the PKGs. There are three different isoforms of PKGs: PKGIα, PKGIβ and PKGII. In the retina the isoform PKGI is more expressed than PKGII and, in particular, it seems that PKGIβ is the most expressed. For this reason, in this project we focus on characterization of PKGIα and PKGIβ function during photoreceptor degeneration. These two isoforms are codified by the same gene and they differ only for the first exon and, at a protein level, are different for the first 100 amino acids. They are so similar that it is really difficult to study the role of one specific isoform in the disease and to differentially downregulate a specific isoform can be really complicated. The aim of this project was to address these problems by using the CRISPR/CAS9 system able to target a specific site in the genome. Two guide RNA (gRNA) were designed: one specific for the α isoform, and the other one specific for PKGI β. These two gRNA can guide the endonuclease CAS9 to a specific target sequence adjacent to the PAM sequence (5’-NGG-3’). The endonuclease generates a double stand brake (DSB) in the DNA immediately downstream to the PAM sequence. The DNA repair mechanism based on NHEJ recombination (Non Homologous End Joining), will generate mutations and, consequently, a KO of the protein of interest. With the aim of editing the two PKGI isoforms, I designed two gRNA. Each gRNA was cloned in the PX459 plasmid that contains the sequence encoding for the CAS9 endonuclease. The plasmids were transfected in the 661W murine photoreceptor cell line. These cells are photoreceptor precursors, are immortalized and express genes that are specific for rod photoreceptors. Taking advantage of the T7 endonuclease I method, I characterized transfected cells and found that genome editing is more efficient for the PKGIβ isoform. This isoform is the one that is more expressed in the retina. The aim of this project was to generate a cellular model to study the cGMP pathway in cells where only a single PKGI isoform is expressed. This new in vitro model will allow the study of the role of the single isoform in the disease and validation of targets of new drugs. Specifically, targets of the drug LP-CN03 will be studied on this model. This compound is an cGMP analogue with an inhibitory activity. Lots of different analogues of cGMP exist, but this one is the more efficient in blocking cGMP targets resulting quite promising for the treatment of the disease. This new model can, thus, help to discover new pathogenetic mechanisms of retinitis pigmentosa and can facilitate the development of new therapies for the treatment of the disease.