Riassunto analitico
Il fattore di trascrizione MEF2C riveste un importante ruolo nella miogenesi e omeostasi del muscolo scheletrico post-natale. La sua attività è regolata da modificazioni post-trascrizionali e post-traduzionali. Lo splicing alternativo del trascritto dà origine a varianti che differiscono nelle loro attività. L'inclusione mutualmente esclusiva degli esoni α1 e α2 si ripercuote principalmente sulla capacità delle varianti di splicing codificate (MEF2Cα1 e MEF2Cα2) di attivare l'espressione genica specifica del muscolo. Inoltre, l'attività della variante MEF2Cα1 è regolata dalla sua fosforilazione sui residui Ser98 e Ser110. Le nostre recenti osservazioni confermano il ruolo di MEF2C nel promuovere il differenziamento dei precursori miogenici e la fusione cellulare nella formazione dei miotubi multinucleati. Infatti, mioblasti trasfettati che over-esprimono entrambe le isoforme, in particolare MEF2Cα1, mostrano un aumento del differenziamento, a livello molecolare e morfologico. Nelle cellule che over-esprimono MEF2Cα1 il differenziamento terminale è potenziato ed è evidente prima dell’aggiunta del terreno di differenziamento a basso siero. In dettaglio, abbiamo osservato un’anticipata espressione dei marker precoci e tardivi del differenziamento: Miogenina e Miosina. Inoltre osserviamo che MEF2Cα1 è efficiente nell’attivare la via di Akt/mTOR/p70S6K, coinvolta nell’omeostasi del muscolo scheletrico. Nelle cellule che over-esprimono MEF2Cα1, troviamo un incremento dei livelli della proteina mTOR, che suggerisce una possibile regolazione trascrizionale diretta del gene mTOR da parte di MEF2C. Dato il coinvolgimento di MEF2C nell’omeostasi muscolare, tramite l’uso di modelli in vitro e in vivo, abbiamo analizzato la sua funzione e regolazione molecolare nella cachessia neoplastica. Essa è una complessa sindrome metabolica multifattoriale caratterizzata dalla perdita di massa muscolare con o senza perdita di massa grassa, responsabile della morte del 20-25% dei pazienti neoplastici. Abbiamo usato un modello in-vitro standardizzato di cachessia neoplastica, trattando per 2 giorni le colture C2C12 di miotubi e mioblasti differenzianti, con i fattori secreti dalle cellule tumorali C26 del carcinoma del colon (Mezzo Condizionato, CM). La sua efficacia nell’inibire il differenziamento e nell’indurre la perdita muscolare è stata testata dalle analisi morfometriche dei seguenti parametri: diametro dei miotubi, numero dei nuclei per miotubo e indice di fusione. Per i modelli in vivo, abbiamo analizzato i tessuti muscolari provenienti da modelli murini ampiamente utilizzati di cachessia neoplastica, ottenuti dal trapianto ectopico delle cellule C26 del carcinoma del colon. Queste analisi, in vitro e in vivo, in accordo con altri modelli di atrofia muscolare analizzati dal nostro gruppo (ad es. da invecchiamento e immobilizzazione dell’arto), evidenziano una riduzione di MEF2C a livello proteico, diversamente dalla fosforilazione sulla Ser 98 dell’isoforma MEF2Cα1, aumentata in queste condizioni patologiche. Esperimenti precedenti svolti all’interno del nostro laboratorio, hanno dimostrato che la fosforilazione sulle Ser98 e Ser110 porta all’interazione di MEF2C α1 con la prolil isomerasi PIN1, che provoca una riduzione della sua stabilità e attività trascrizionale. Questi risultati suggeriscono un’alterata funzione di MEF2C nella progressione dell’atrofia muscolare. In più, noi proponiamo che la deregolazione di MEF2C possa essere correlata ad un’attivazione aberrante della pathway di Akt/mTOR/p70S6K, osservata nella cachessia neoplastica. Noi ipotizziamo che la fosforilazione di MEF2C possa giocare un ruolo importante nella patogenesi della cachessia neoplastica, rappresentando un target promettente per sviluppare un approccio terapeutico per trattare questa patologia.
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Abstract
The Myocyte Enhancer Factor 2C (MEF2C) transcription factor plays an important role in skeletal myogenesis and in post-natal muscle homeostasis. Its activity is finely regulated by post-transcriptional and post-translational modifications. The transcript undergoes alternative splicing giving rise to several splice variants that differ profoundly in their activities. Mutually exclusive inclusion of α1 and α2 exons has a major impact on the ability of the encoded splice variants (MEF2Cα1 and MEF2Cα2) to activate muscle-specific gene expression. Furthermore, the activity of MEF2Cα1 variant is regulated by its phosphorylation on Ser98 and Ser110 residues.
Our recent observations confirm the pivotal function of MEF2C in promoting myoblast differentiation and cell fusion into multinucleated myotubes. Indeed, transfected myoblasts that over-express both MEF2Cα1 and MEF2Cα2 isoforms, show an increase in myogenic differentiation, both at the molecular and morphological level, in particular MEF2Cα1. Terminal differentiation is particularly enhanced in cells overexpressing MEF2Cα1 even before stimulating it by shifting cells to low serum differentation medium. In particular, we observed a precocious expression of early and late markers of differentiation, i.e. Myogenin and Myosin. In addition, we found that MEF2Cα1 is very efficient in activating the Akt/mTOR/p70S6K pathway, involved in skeletal muscle homeostasis. Furthermore, in cells that overexpress the MEF2Cα1 variant, we observed an increase of the mTOR protein level, suggesting a possible direct transcriptional regulation of the mTOR gene by MEF2C.
Given the involvement of MEF2C in muscle homeostasis, we decided to investigate its function and molecular regulation in cancer cachexia, a pathological condition where muscle homeostasis is dysregulated, by using in vitro and in vivo models. Cancer cachexia is a complex metabolic syndrome characterized by loss of muscle with or without loss off fat mass, responsible for the death of 20-25 % of cancer patients.
We used a standardized in-vitro model of cancer cachexia by treating cultured C2C12 differentiating myoblasts or myotubes with Colon – 26 Carcinoma Cells - derived factors (conditioned Medium CM) for 2 days. The efficacy of CM to inhibit differentiation and induce muscle loss is tested by morphometric analyses of the following parameters: diameter of myotubes, number of nuclei per myotube and fusion index. As in vivo model we analysed muscle tissue from a widely used mouse models of cancer cachexia obtained by performing an ectopic graft of C26 colon cancer cells.
These in vitro e in vivo analysis, in agreement with other muscle atrophy models analysed by our group (i.e. by aging and limb immobilization) show a reduction of MEF2C protein level, while the phosphorylation of MEF2Cα1 on Ser98, is increased in these pathological conditions.
Previous studies performed in our laboratory, showed that phosphorylation on Ser98 and Ser110 leads to the interaction of MEF2Cα1 with the prolyl isomerase PIN1 that results in a reduction of its stability and transcriptional activity. Altogether our results suggest an impaired MEF2C function in the progression of muscle atrophy. Furthermore, we suggest that MEF2C deregulation could be related to the aberrant activation of the Akt/mTOR/p70S6K pathway that is observed in cancer cachexia.
We hypothesize that phosphorylation of MEF2C might play an important role in the pathogenesis of cancer cachexia, thus representing an important target to develop a therapeutical approach to treat this important pathology.
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