Riassunto analitico
La riduzione del consumo di sale rappresenta uno degli obiettivi fissati dal Piano d’azione globale per la prevenzione e il controllo delle malattie non trasmissibili 2013-2020 dell’Oms, fra cui le malattie cardio-vascolari. Il Parmigiano Reggiano (PR) rappresenta uno dei più noti esempi di alimenti funzionali italiani, con proprietà benefiche per la salute umana non solamente correlabili alle sue proprietà nutrizionali, ma anche alla presenza di composti con documentata funzionalità. Fra questi, i peptidi bioattivi derivati dalle caseine del latte sono specifici frammenti proteici che esercitano azioni positive sulle funzionalità cellulari, quali attività anti-ipertensive, anti-ossidanti, immuno-modulatorie e anti-microbiche. Valina-Prolina-Prolina (VPP) e Isoleucina-Prolina-Prolina (IPP) rappresentano i peptidi bioattivi con più documentata attività anti-ipertensiva sia in vivo che in vitro. Nel PR, la loro presenza dipende da un delicato equilibrio fra formazione e degradazione ad opera della microflora lattica. I batteri lattici (LAB) del genere Lactobacillus possiedono, infatti, un complesso sistema proteolitico che consente loro di degradare le caseine e liberare peptidi e aminoacidi necessari alla loro crescita. Fra questi i non-starter LAB (NS-LAB) rappresentano la frazione microbica dominante nella stagionatura del PR e ne modificano le proprietà sensoriali ed il contenuto in peptidi bioattivi.
La presente tesi di ricerca si propone di caratterizzare il peptidoma e la popolazione NS-LAB in due set di campioni di PR stagionato a 12 mesi a diverso contenuto di sale e di grasso. Ventiquattro campioni di formaggio PR provenienti dalle province di Modena, Reggio Emilia, Mantova e Parma, sono stati caratterizzati dal punto di vista chimico-fisico mediante tecnologia NIR allo scopo di individuare due subsets di 6 campioni ciascuno, rispettivamente a basso contenuto di NaCl (< 2.1g/100g ss) e grassi (<44.5g/100g ss) (subset BB) e ad alto contenuto di NaCl (> 2.1g/100g ss) e grassi (>44.5g/100g ss) (subset AA). Per entrambi i set di campioni, il profilo peptidomico è stato determinato mediante spettrometria di massa LC-ESI-QTOF. La popolazione lattica mesofila coltivabile è stata stimata in un range di 6.10 x 103 e 3.57 x 106 UFC/g nel subset BB, mentre si attestava fra 9.9 x 104 e 2.21 x 106 UFC/g nel subset AA. Per ogni subset di campioni un totale di 72 isolati Gram-positivi e catalasi-negativi è stato sottoposto ad identificazione a livello di specie mediante analisi del polimorfismo della lunghezza dei prodotti di PCR del gene housekeeping tuf codificante per il fattore di elongazione Tu (EF-Tu). Nel subset BB, il 69,4% degli isolati appartenevano alla specie Lactobacillus paracasei, mentre il 30,6% alla specie Lactobacillus rhamnosus. Nel subset AA L. rhamnosus è stata la specie dominante. L’analisi di clustering UPGMA dei profili (GTG)5 REP-PCR ha consentito di differenziare 34 isolati L. paracasei in 12 genotipi, e 37 isolati L. rhamnosus in 11 genotipi, permettendo di selezionare un pool non ridondante di 23 ceppi, da sottoporre a successivo screening in latte. Due ceppi, L. rhamnosus 2006 e 0503, hanno mostrato la maggiore produzione di VPP e IPP (misurata come AUC, area under curve) e grado proteolitico dopo 72h di fermentazione in latte. L. rhamnosus 2006 ha presentato una cinetica di crescita in latte più veloce rispetto a L. rhamnosus 0503 e ha prodotto un latte fermentato con maggiore attività anti-ipertensiva (misurata come attività inibitoria verso l’enzima ACE) e antiossidante, suggerendo come il contenuto in peptidi bioattivi prodotto dal ceppo 2006 sia maggiore rispetto al ceppo 0503. La presente tesi rappresenta il primo studio volto a correlare il profilo peptidomico e la frazione mesofila NS-LAB al contenuto di sale e grassi nel PR a 12 mesi di stagionatura e fornisce un ceppo candidato, L. rhamnosus 2006, per la produzione di bevande fermentate arricchite in peptidi bioattivi.
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Abstract
Decreasing population salt intake worldwide meets the WHO’s global targets for non-communicable disease reduction, including cardiovascular diseases. Parmigiano Reggiano cheese (PR) is the most famous Italian functional food thanks to positive nutritional features (i.e. absence of lactose) and the presence of health-promoting compounds. In particular, bioactive peptides from milk caseins may exhibit anti-hypertensive, anti-oxidant, immuno-modulatory and anti-microbial activities. Valine-Proline-Proline (VPP) and Isoleucine-Proline-Proline (IPP) are bioactive peptides displaying well-documented anti-hypertensive activity both in vitro and in vivo. The occurrence in PR depends upon the balance between release and degradation by the proteolytic action of lactic acid bacteria (LAB) inhabiting cheese environment. These bacteria possess a complex proteolytic system that allows the of release amino acid and peptides required for their survival. During PR ripening, mesophilic non-starter LAB represent the dominant microbial fraction affecting both sensorial properties and bioactive peptide content of the final ripened product. In the present study, both the cultivable non-starter-LAB fraction and peptidome profile were characterized in Parmigiano Reggiano cheeses with different salt and fat contents. For these purposes, 24 PR samples were collected after 12 months ripening from manufactures in north Italian Provinces of Modena, Reggio Emilia, Mantova and Parma. Based on NIR-derived chemico-physical parameters, we selected 6 samples with low NaCl and fat contents (sample subset LL for brevity), and 6 samples with high NaCl and fat contents (sample subset HH for brevity) using 2.1% (g/100 dw) NaCl and 44.5% (g/100 dw) fat contents as cut-off values. Peptidome profile was determined by LC-ESI-QTOF mass spectrometry in order to identify possible bioactive peptides in both sample subsets. NS-LAB mesophilic viable counts were from 6.10 x 103 to 3.57 x 106 CFU/g in samples LL and from 9.9 x 104 to 2.21 x 106 CFU/g in samples HH. For every sample subset, 72 Gram-positive and catalase negative isolates were identified based on PCR product length polymorphism analysis of tuf gene encoding for elongation factor EF-TU. In sample subset LL, 69,4% of isolates belonged to species Lactobacillus paracasei, while the remaining isolates belonged to Lactobacillus rhamnosus. In samples HH the dominant species was L. rhamnosus (74,28% of isolates). (GTG)5-based REP-PCR fingerprinting yielded a total of 12 genotype for L. paracasei and a total of 11 genotype for L. rhamnosus, providing a pool of 23 genetically distinct strains for the subsequent functional screening. For four representative strains species identification was also confirmed by 16S rRNA gene sequencing. VPP and IPP production and proteolytic degree were evaluated after 72h incubation in milk, to select L. rhamnosus strains 2006 and 0503 as the most proteolytic and the best VPP/IPP-producers. Milk fermentation monitoring over time showed that strain 2006 overcame strain 0503 in acidification performance, providing a fermented milk with higher anti-hypertensive and anti-oxidant activities compared to that obtained by strain 0503. These results suggest that L. rhamnosus 2006 could release more bioactive peptides higher than L. rhamnosus 0503. In conclusion we first correlated NS-LAB cultivable fraction and peptidome to salt and fat content in ripened PR cheeses and provided one promising adjunct culture, L. rhamnosus strain 2006, for producing fermented milk enriched in bioactive peptides.
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