• , syringae
• actinidiae
• kiwifruit
• Pseudomonas
• pv.

Il cancro batterico è la malattia più distruttiva dell’actinidia. L’agente causale è il batterio Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa), per il quale è descritta una significativa epifitia ed endofitia. Inizialmente abbiamo studiato il ciclo del patogeno. Campionamenti sono stati fatti per più anni in Romagna, con lo scopo di isolare il patogeno. I nostri risultati hanno mostrato che Psa può sopravvivere su foglie asintomatiche. Psa è stato anche isolato da fiori, polline e gemme in frutteti con la presenza della malattia. Sui frutti, popolazioni epifite di Psa sono state rilevate fino ad Agosto. E’ stato studiato il ruolo del polline nella disseminazione del patogeno e della malattia: polline contaminato è stato raccolto in actinidieti con la malattia e usato per impollinare un actinidieto privo di contaminazione. In seguito sono stati fatti rilievi per rintracciare il patogeno nell’impianto sperimentale e per monitorare l’eventuale sviluppo della malattia. Il batterio è stato trovato durante tutta la stagione vegetativa, ma nessun sintomo di malattia si è sviluppato il primo anno. L’anno successivo i monitoraggi hanno confermato la presenza di Psa in fase epifita ma, su alcune piante, sono stati ritrovati sintomi della malattia. Pertanto è stato dimostrato che il polline contaminato da Psa può disseminare il e causare scoppi epidemici della malattia. Durante pluriennali rilievi di campo sono stati isolati negli actinidieti batteri epifiti ed endofiti: essi sono stati usati per studiare il microbioma dell’actinidia. Inoltre, tali batteri sono stati saggiati per il loro potere antagonista di Psa, per la presenza di sequenze geniche codificanti resistenza al rame, per la possibilità di agire quali nuclei di condensazione del ghiaccio. Il risultato principale di queste ricerche è stato quello di aver individuato un buon numero di batteri antagonisti a Psa. Tali batteri sono stati caratterizzati come appartenenti alle famiglie delle Pseudomonadaceae e delle Enterobacteriaceae. Un endofita è stato molto attivo nell’inibizione di Psa in vitro: tale antagonista è stato usato per delle prove di lotta in campo. Esperimenti preliminari hanno mostrato che le piante trattate con tali antagonisti non hanno mostrato sintomi di malattia, mentre quelle di controllo hanno sviluppato alcuni sintomi. Il controllo della trasferibilità a Psa di geni per la resistenza al rame ha mostrato che gli epifiti resistenti non possono trasferire questa peculiarità a Psa. La capacità di nucleare il ghiaccio è stata verificata per 6 isolati epifiti. Un antagonista è stato selezionato per una successiva identificazione per studiare la sua abilità a colonizzare piante di actinidia e interferire endofiticamente con Psa. L’identificazione di tale antagonista è stata fatta con l’analisi del profilo degli esteri metilici di acidi grassi (FAME) e mediante il sequenziamento del 16S rRNA: tali saggi hanno permesso di identificare l’antagonista come Pseudomonas synxantha, un membro del gruppo Pseudomonas fluorescens. In seguito sono stati ottenuti un mutante RFP dell’antagonista e un mutante GFP di Psa, con lo scopo di studiare la loro colonizzazione endofita: i risultati hanno mostrato che Pseudomonas synxantha è in grado di colonizzare l’actinidia. Tale antagonista è stato scelto per successivi studi. E’ stata costituita una banca di mutanti deficienti nella loro attività antagonista mediante mating triparentale con il ceppo di Escherichia coli S17 pCRS530 (mTn5GUS) e E. coli pRK2013. Sono stati ottenuti 56 mutanti. Tuttavia, 34 dei mutanti hanno mostrato avere l’inserzione del plasposone nel sistema GacA/GacS, noto per essere coinvolto nella produzione di metaboliti secondari. Tali mutanti sono stati esclusi dall’analisi. I rimanenti mutanti sono stati studiati per l’identificazione dei geni effettivamente coinvolti nell’antagonismo a Psa.

The bacterial canker of kiwifruit is the most destructive disease of cultivated Actinidia spp. The causal agent is the Gram negative bacterium Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa), which has significant epiphytic and endophytic life phases. Our first approach was to understand its life cycle in kiwifruit orchards. Multiannual sampling was done in Romagna, in order to isolate the pathogen. Our results showed that Psa may survive through the whole growing season on symptomless leaves. Psa was also isolated from symptomless flowers, pollen and buds in spring, in orchards with the disease. On fruits, epiphytic Psa was detected until early August. The role of pollen in the dissemination of the pathogen and the spread of disease was investigated. Pollen collected from orchards with the disease was found contaminated by Psa. Pollination with naturally contaminated pollen and monitoring of Psa presence and development of disease was done. The pathogen was found in the pollinated plots throughout the whole season, but no disease symptoms developed during the first year of observation. The following year, monitoring of Psa presence in the experimental orchard still confirmed the presence of the pathogen and, additional monitoring, revealed the development of typical symptoms on a few trees. Therefore, we conclude that naturally contaminated pollen was able to disseminate Psa and spread the disease into a new orchard. Epiphytes and endophytes were isolated from several kiwifruit orchards in order to study the microbiome of Actinidia spp. They were checked in order to find possible antagonists to Psa, search the presence of copper resistant bacteria able to transfer such resistance to Psa and study their possible ice nucleation activity. As a result of such activity we obtained a number of effective antagonists. A preliminary identification showed that those antagonists belonged to the families of Pseudomonadaceae and Enterobacteriaceae. An endophyte was very active in inhibiting in vitro any bacterial pathogen assayed. This antagonist was used in orchard experiments to control Psa. Such experiment highlighted that treated plants didn’t show symptoms, whereas non treated showed some disease symptoms, but data obtained didn’t have a statistical significance. The control of transferability of copper resistance genes from other bacteria species to Psa led to the conclusion that it is not possible for Psa to integrate these genes. The ice nucleation activity test revealed that six epiphytes isolated from kiwi plants were able to provoke freezing of water even at -4°C. These species might form additional wounds on the plant which facilitate the entrance of Psa into the host. One antagonist was selected for further identification and additional experiments, in order to understand its ability to colonise actinidia plants, to interfere with Psa endophytically, and to highlight the molecular basis of its antagonism to Psa. Fatty acid methyl ester (FAME) analysis and 16S RNA sequencing resulted in identifying the antagonist as Pseudomonas synxantha, member of the Pseudomonas fluorescens group. An antagonist RFP mutant and a Psa GFP mutant were obtained for colonisation studies. The RFP mutant was inoculated into actinidia trunk and was able to colonise the host plant tissue. The antagonist was chosen for further molecular studies. A bank of mutants, deficient in their antagonistic activity, was constructed by means of triparental mating with strains Escherichia coli S17 pCRS530 (mTn5GUS) and E. coli pRK2013. Fifty-six mutants were obtained. However 34 were found to have the plasposon insertion into the GacA/GacS system, known to be involved in controlling the production of secondary involved in pathogenicity to plants, and were excluded from further analysis. The remaining mutants are used for the identification of genes involved in the antagonism to Psa.