Riassunto analitico
La trascrizione delle informazioni genetiche codificate dal DNA è regolata da fattori di trascrizione e da modificazioni post-traslazionali delle code istoniche, quest’ultime chiamate “codice istonico”. Molti studi si sono concentrati sulla correlazione fra l’attivazione e la repressione della trascrizione e il codice istonico. L’acetilazione degli istoni, regolata dagli enzimi istone aciltransferasi e istone deacetilasi, è associata all'attivazione della trascrizione, mentre la metilazione dei residui di lisine delle code istoniche, controllata dalle metil-transferasi istoniche e dalle demetilasi istoniche (KDMs), è più versatile in quanto, a seconda del residuo di lisina coinvolto, può essere collegata all’attivazione della trascrizione o alla repressione. Lisine-Specific demethylase-1 (LSD1), è stato il primo enzima KDM descritto ed è una monoamino ossidasi che può demetilare residui di lisine in posizione 4 o 9 dell'istone 3, e quindi promuovere la repressione della trascrizione o l'attivazione. Recenti pubblicazioni hanno dimostrato che LSD1 è coinvolto nell’attivazione di geni chiave dello sviluppo e del differenziamento tissutale. Il progetto di questa tesi è lo studio di un possibile ruolo di LSD1 nel differenziamento del muscolo scheletrico. Il muscolo scheletrico è un tessuto muscolare striato con caratteristiche eterogenee che svolge molteplici funzioni chiave nell'organismo. Il differenziamento muscolare ha inizio con una cascata di segnali trascrizionali complessi, che portano all’attivazione dei geni regolatori specifici quali MyoD, Myf-5, MRF4, e MyoG. Mentre MyoD, Myf5, e MRF4 sono importanti fattori di determinazione muscolare, MyoG agisce come fattore di differenziamento, controllando insieme a MyoD e MRF4, il differenziamento dei mioblasti in miotubi. Dall’identificazione del gene MyoD, ne è stato ampiamente dimostrato il suo ruolo nella determinazione e differenziamento muscolare, tuttavia quale sia il controllo trascrizionale di quest’ultimo, rimane poco definito. Scopo di questa tesi è stato quello di dimostrare se LSD1 è coinvolto nel controllo trascrizionale di MyoD, a tal fine ho utilizzato due approcci, uno in vivo ed un altro in vitro. In particolare inattivando il gene LSD1, utilizzando un ceppo di topi transgenici PAX3-cre, ho osservato una riduzione dell'attivazione trascrizionale del gene MyoD nei somiti, e quindi una forte riduzione del numero di cellule muscolari differenziate. In accordo con questi risultati, silenziando in vitro il gene LSD1, ho osservato, durante il differenziamento delle cellule C2C12, un modello murino di mioblasti, una diminuzione statisticamente significativa dell'espressione genica e proteica di MyoD nei cloni dove LSD1 è stabilmente silenziato rispetto a quelli di controllo. Sia i risultati in vivo che in vitro suggeriscono quindi che LSD1 potrebbe essere coinvolto nella regolazione trascrizionale di MyoD. L'espressione di MyoD è sotto il controllo di due regioni regolative, il core enhancer (CE) e distal regulatory region. Tramite un esperimento d’immunoprecipitazione della cromatina ho dimostrato che LSD1 è presente sul CE dove promuove la demetilazione del residuo di lisina in posizione 9 dell’istone 3 durante il differenziamento dei mioblasti. Recentemente è stato dimostrato che il CE trascrive un RNA enhancer (CEeRNA), la cui funzione è attivare la trascrizione del gene MyoD durante il differenziamento. L'assenza di LSD1 durante il differenziamento sia in vivo che in vitro impedisce l'attivazione della trascrizione di tale CEeRNA portando quindi ad una lenta attivazione dell’espressione genica di MyoD e ad un ritardo del differenziamento delle cellule muscolari. Complessivamente questi risultati indicano che LSD1 svolge un ruolo chiave nel differenziamento muscolare, poiché responsabile dell’attivazione del CEeRNA e quindi dell’espressione di MyoD.
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Abstract
The transcription of genetic information encoded in DNA is regulated by transcription factors and by post-translational modifications of histone proteins’ tails, named histone code. Such “histone code” together with DNA methylation is part of the epigenetic code, which is cell and tissue specific. Many studies have focused on the correlation between transcriptional activation/repression and the histone code. While histone acetylation, regulated by histone acetyl transferases (HATs) and histone deacetylases (HDACs), is commonly associated with transcription activation, histone methylation, which is controlled by histone methyltransferases (KMTs) and histone demethylases (KDMs) is more versatile since lysines methylation can either be linked to transcription activation or repression, depending on the position of the lysine residue involved. Lysine-Specific Demethylase-1 (LSD1), is the first histone demethylase described and is a monoamine oxidase that can de-methylate lysine 4 or 9 of histone 3, and therefore promote transcriptional repression or activation, respectively. Current literature points to a critical role for LSD1 in the regulation of developmental and differentiation genes. The aim of this thesis is the investigation of a possible role of LSD1 in skeletal muscle differentiation. Skeletal muscle is a striated muscle tissue with complicated and heterogeneous features that serves multiple critical functions in the organism. Myogenesis is initiated by complex signaling and transcriptional cascades, which lead to the activation of the lineage-specific regulatory genes MyoD, Myf-5, MRF4, and Myogenin. While MyoD, Myf5, and Mrf4 function as myogenic determination factors, Myogenin, similar to Mrf4 and MyoD, acts as a differentiation factor, controlling the differentiation of myoblasts into skeletal muscle fibers. Since MyoD discovery, it has been widely demonstrated that it is a determination factor and downstream member of the myogenic program. However, the transcriptional control of this important gene remains poorly defined. Goal of my work was to demonstrate if LSD1 could be involved in the transcriptional regulation of MyoD gene. To achieve this aim I have used both in vivo and in vitro approaches. In particular, I have found that the inactivation of LSD1, by using a pax3-cre transgenic mouse strain, causes a strong reduction of MyoD activation in the somites, and thereby a strong reduction of the number of differentiated muscle cells. Consistent with these results, by using an shRNA in vitro strategy, I have observed during differentiation of C2C12, a mouse model of myoblast cell, a statistically significant decrease of MyoD gene expression and, thus, protein in the shLSD1 C2C12 stable clones in comparison with the control one. Together in vivo and in vitro results suggest that LSD1 might be involved in the transcriptional regulation of MyoD gene. The known genetic regulatory elements controlling MyoD expression are the core enhancer (CE) and distal regulatory region (DRR). By using a Chromatin immunoprecipitation assay (ChIP) I have shown that LSD1 binds to the CE region where it promotes H3K9 demethylation during myoblast differentiation. Recently, it has been demonstrated that the CE transcribes an RNA enhancer (CEeRNA) that modulates the transcription of MyoD gene during muscle differentiation. Here I have demonstrated that the absence of LSD1 during in vivo and in vitro muscle differentiation prevents the transcription activation of CEeRNA leading to a delay in the MyoD gene expression and thus in the muscle cell differentiation. Altogether these results indicate that LSD1 participates to the establishment of the muscle lineage and in the muscle differentiation, playing a role in the timing of MyoD activation by controlling the transcriptional activation of the CEeRNA.
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