Riassunto analitico
La timidilato sintasi umana ( hTS ) è un enzima essenziale per la sopravvivenza della cellula per il suo importante ruolo nella sintesi e riparazione del DNA . All’ interno del nucleo della cellula eucariota, la timidilato sintasi catalizza la metilazione riduttiva del 2’-deossiuridina-5’-monofosfato (dUMP) a 2’deossitimidina-5’-monofosfato (dTMP), utilizzando come cofattore l’acido N5-N10-metilentetraidrofolico. Successivamente, il dTMP viene convertito, tramite due passaggi di fosforilazione, a 2’-deossitimidina-5’trifosfato (dTTP), un precursore importante per la sintesi del DNA. Per questa ragione, l’hTS rappresenta da oltre 50 anni un target importante per la terapia antitumorale del tumore colon-retto e ovarico. Attualmente in terapia, l’inibizione della timidilato sintasi è ottenuta tramite inibitori ortosterici che si legano alla proteina a livello del sito attivo, andando a competere con il substrato dUMP, tra cui la 5’-desossiuracile monofosfato (metabolita attivo del profarmaco 5-FU), oppure tramite inibitori del sito del cofattore, tra cui metotressato (MTX), raltitrexed (RTX), e pemetrexed (PTX). Un effetto avverso di questi inibitori, d’altra parte, è l’induzione dello sviluppo di resistenze associate all’aumento dei livelli di hTS nucleare, e questo porta parte delle terapie con i farmaci anti tumorali classici al fallimento . Recentemente, è stato dimostrato che la timidilato sintasi si trova all’ interno della cellula in equilibrio tra la sua forma dimerica ( attiva ) e la sua forma monomerica ( inattiva ) . Inoltre, la forma monomerica inattiva di hTS interagisce con il suo mRNA tramite un meccanismo di regolazione a feedback negativo, regolando la sua espressione e quelle di proteine coinvolte nei processi apoptotici . Partendo da questa attività biologica secondaria di hTS, è stata studiata una strategia di medicinal chemistry alternativa che ci ha condotto alla scoperta degli inibitori dissociativi (DDIS) , molecole farmacologicamente attive che non si legano al sito attivo dell’enzima, ma funzionano da inibitori allosterici e legano l’enzima a livello dell’interfaccia dei due monomeri, spostando l’equilibrio monomero-dimero verso la forma monomerica dell’enzima . All’ interno del laboratorio di Drug Discovery & Biotechnology (Dipartimento di Scienze della Vita di UniMoRe), dove ho condotto il mio lavoro di tesi, sono stati sviluppati tre librerie di DDIS, e tra oltre 200 composti, AIC-A016 è stato identificato come lead compound. Le caratteristiche che hanno portato ad identificarlo come lead sono: i. buona capacità di inibizione dell’enzima dimostrato tramite studi on target (IC50=6); ii. buona capacità dissociativa dimostrata tramite analisi di FRET ( Kd = 4 ). D’altraparte, AIC-A016 non mostra buoni dati di inibizione a livello cellulare . Pertanto, è stato intrapreso un programma di ottimizzazione che ha portato alla sintesi di nuovi 22 derivati (AIC-D), che migliorano la solubilità di AIC-A016 ed eliminano il nitrogruppo aromatico tossicoforo. Durante il mio periodo di tesi mi sono occupata dei seguenti aspetti: 1) Purificazione e caratterizzazione del hTS-WT attraverso l’uso di GE ÄKTA Prime FPLC, Determinazione della Kcat dell’enzima e della Km dell’enzima verso il substrato dUMP e il cofattore mTHF. 2) Test di inibizione on-target per la valutazione delle IC50 dei nuovi derivati per hTS. 3) Coniugazione della proteina hTS-WT con sonde fluorescenti per test di FRET, per la valutazione delle capacità dissociative dei composti . 4 ) Analisi della capacità dissociativa degli inibitori tramite cromatografia ad esclusione dimensionale e a scambio anionico. Dai risultati ottenuti tramite i sopra citati esperimenti di chimica biologica, sarà poi possibile sintetizzare nuove molecole con aumentata attività inibitoria
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