• batteri
• isolamento
• microbiota
• proteolitici
• tipizzazione

La descrizione del rapporto simbiotico fra l’uomo e il suo microbiota intestinale si basa soprattutto su indagini metagenomiche, La maggior parte dei battei anaerobi stretti dell’intestino è ancora difficilmente coltivabile e comunque non sono disponibili informazioni sulla specifica funzione dei singoli microrganismi e sulla variabilità di comportamento all’interno della stessa specie. La possibilità di coltivare questi batteri è indispensabile per comprendere l’interazione con l’ospite sulla base dei metaboliti prodotti, delle attività enzimatiche espresse, delle trasformazioni a carico di fitochimici e xenobiotici, dell’immuno modulazione.
L’obiettivo di questo lavoro di tesi costituisce un contributo all’allargamento della collezione di batteri anaerobi stretti intestinali facente capo al Laboratorio di Microbial Biotechnologies and Fermentation Technologies - DSV. Nello specifico il lavoro svolto è stato finalizzato all’isolamento, alla tipizzazione e alla caratterizzazione tassonomica di batteri proteolitici isolati da campioni fecali di soggetti sani.
Nel contesto di questo progetto ci si è occupati dell’isolamento di batteri proteolitici da campioni fecali di 7 soggetti sani. I campioni fecali freschi raccolti in stretta anaerobiosi sono stati utilizzati come inoculo di un mezzo colturale nel quale proteine e peptidi (Proteo Fermenter Medium - PFM) costituiscono la sola fonte di carbonio per favorire lo sviluppo dei soli batteri proteolitici. Tutte le operazioni di arricchimento, isolamento su piastra e purificazione degli isolati sono state condotte in camera anaerobica, mantenendo sempre le colture in terreni PFM. Dei singoli cloni ottenuti da ciascun campione fecale è stata fatta l’estrazione del DNA genomico tramite Instagene Matrix, per procedere alla tipizzazione degli isolati mediante RAPD-PCR. I singoli biotipi sono stati quindi classificati a livello tassonomico mediante sequenziamento della regione ipervariabile V3-V4 del gene codificante l’rRNA 16S. Le sequenze ottenute sono state poi sottoposte al confronto con quelle depositate nel database Gene Bank per identificare genere e specie.
I batteri proteolitici isolati appartengono alle seguenti specie: Bacteroides caccae, Bacteroides cellulosilyticus, Bacteroides coprocola, Bacteroides dorei, Bacteroides fragilis, Bacteroides intestinalis, Bacteroides massiliensis, Bacteroides ovatus, Bacteroides stercoris, Bacteroides uniformis, Bacteroides vulgatus, Bacteroides xylanisolvens, Parabacteroides distasonis, Parabacteroides johnsonii, Parabacteroides merdae, Acidaminococcus intestini, Alistipes shahii, Anaerostipes hadrus, Collinsella aerofaciens, Enorma timonensis, Eubacterium contortum, Gemmiger formicilis, Odoribacter splanchnicus, Prevotella copri, Ruminococcus faecis, Shigella sonnei. I generi maggiormente rappresentati sono Bacteroides e Parabacteroides.
Per determinare se questi batteri hanno un tipo di metabolismo solo proteolitico o se possono sviluppare anche su carboidrati complessi come fonte di carbonio e di energia, essi sono stati trasferiti in un mezzo colturale contenente oligo e polisaccaridi, e si è visto che alcuni sono anche saccarolitici, mentre altri prediligono un metabolismo proteolitico.

The description of the symbiotic relationship between human and his intestinal microbiota is based on metagenomic investigations. Most of the obligate anaerobe of the gut are still difficult to cultivate and in any case no information is available on the specific function of the single microorganisms and on the variability of behavior within the same species. The possibility of cultivating these bacteria is essential to understand the interaction with the host on the basis of the produced metabolites, of the expressed enzymatic activities, of the phytochemical and xenobiotic transformations, of the modulation immuno. The aim of this thesis work is a contribution to the enlargement of the collection of the intestinal obligate anaerobic bacteria , which is part of the Laboratory of Microbial Biotechnologies and Fermentation Technologies - DSV. Specifically, the work carried out was aimed to isolation, typing and taxonomic characterization of proteolytic bacteria isolated from faecal samples of healthy subjects. In the context of this project, we took care of the isolation of proteolytic bacteria from fecal samples of 7 healthy subjects . Fresh fecal samples collected in close anaerobiosis have been used as inoculum of a culture medium in which proteins and peptides (Proteo Fermenter Medium - PFM) are the only carbon source to favor the development of proteolytic bacteria alone. All enrichment, isolation and Petri dish purification operations were carried out in an anaerobic chamber, always in PFM cultures. From the single clones obtained from each faecal sample, genomic DNA extraction was performed through Instagene Matrix, to proceed with the typing of the isolates by RAPD-PCR. The single biotypes were then classified at the taxonomic level by sequencing the hypervariable region V3-V4 of the gene encoding the 16S rRNA. The sequences obtained were then compared to the sequences deposited in the Gene Bank database to identify genus and species. The isolated proteolytic bacteria belong to the following species: Bacteroides caccae, Bacteroides cellulosilyticus, Bacteroides coprocola, Bacteroides dorei, Bacteroides fragilis, Bacteroides intestinalis, Bacteroides massiliensis, Bacteroides ovatus, Bacteroides stercoris, Bacteroides uniformis, Bacteroides vulgatus, Bacteroides xylanisolvens, Parabacteroides distasonis, Parabacteroides johnsonii , Parabacteroides merdae, Acidaminococcus intestini, Alistipes shahii, Anaerostipes hadrus, Collinsella aerofaciens, Enorma timonensis, Eubacterium contortum, Gemmiger formicilis, Odoribacter splanchnicus, Prevotella copri, Ruminococcus faecis, Shigella sonnei. The most represented genus are Bacteroides and Parabacteroides. To determine if these bacteria have a type of proteolytic only metabolism or if they can also develop on complex carbohydrates as carbon and energy source, they have been transferred into a culture medium containing oligo and polysaccharides, and it has been seen that some are also saccharolytic , while others prefer a proteolytic metabolism.