• Cell-signaling
• Osteocita
• Osteogenesi
• Rigenerazione-ossea
• Teriparatide

Lo scopo della presente tesi di dottorato è stato quello di analizzare gli aspetti strutturali ossei le modificazioni del cell-signalling osteocitario durante la riparazione di lesioni scheletriche indotte (in vivo) e in un modello cellulare immortalizzato (in vitro) a seguito del trattamento con Teriparatide (farmaco osteo-protettore).
Il Teriparatide è il frammento attivo (1-34) dell’ormone paratiroideo umano endogeno (PTH). A dosaggi fisiologici il PTH induce ipercalcemia: in parte questo effetto è realizzato aumentando l’assorbimento intestinale di calcio ed incrementando il suo riassorbimento tubulare a livello renale; tuttavia, in condizioni non fisiologiche, l’ipercalcemia si realizza in modo consistente incrementando il riassorbimento osseo. E’ stato dimostrato che dosaggi cronicamente elevati di PTH comportano una riduzione della massa ossea mentre un'esposizione intermittente al PTH attiva gli osteoblasti più di quanto non agisca sugli osteoclasti. In particolare, è stato dimostrato che l’esposizione intermittente al PTH produce un netto aumento della densità minerale ossea, contrariamente al marcato riassorbimento osseo che si verifica a seguito di un’esposizione continua allo stesso ormone.
Gran parte degli studi strutturali hanno focalizzato la loro attenzione sull’effetto quantitativo del Teriparatide nella neo-deposizione di osso, senza indagare la qualità del tessuto neoformato; inoltre, da un punto di vista molecolare, la maggior parte delle ricerche finora condotte hanno prediletto lo studio dell’attività degli osteoblasti nel processo di riparazione ossea, tralasciando il ruolo fondamentale che gli osteociti giocano mediante la modulazione del loro cell-signalling. Gli osteociti sono infatti gli attori principali della comunicazione tra le cellule ossee, in particolare con gli osteoblasti con cui sono in diretta connessione tramite prolungamenti citoplasmatici e giunzioni specializzate (di tipo gap).
Durante la rigenerazione ossea vengono ripercorse le tappe tipiche dell’ossificazione membranosa; dopo la preliminare formazione di tessuto fibroso e la successiva proliferazione vascolare si susseguono due diversi tipi di osteogenesi: dapprima l’Osteogenesi Statica che, in base a fattori induttivi di origine vascolare, produce in fretta un preliminare trabecolato osseo e successivamente l’Osteogenesi Dinamica in cui gli osteoblasti, guidati dagli osteociti, producono un osso meccanicamente più valido. Allo stato attuale non risultano indagini focalizzate sulle relazioni funzionali tra osteociti e osteoblasti durante il processo di riparazione dell’osso con/senza farmaci.
Al fine di approfondire questo aspetto, il mio lavoro di dottorato si è concentrato inizialmente sull’analisi strutturale qualitativa della riparazione di lesioni sperimentalmente indotte in diafisi di femore di ratto e successivamente sull’analisi del cell-signalling osteocitario in vitro, entrambe in risposta al trattamento con Teriparatide.
I risultati della sperimentazione nel modello animale hanno mostrato che la somministrazione intermittente di Teriparatide accelera la comparsa dell’Osteogenesi Dinamica nel produrre un osso meccanicamente più valido. I dati di biologia molecolare su un modello cellulare immortalizzato osteocitario (MLO-Y4) trattato con il farmaco hanno mostrato (mediante analisi Microarray), a tempi differenti di trattamento, una diversa espressione dei geni coinvolti nel signaling osteocitario rispetto alla condizione di controllo. Il conseguimento di tali risultati ci ha indotto ad un approfondimento della tematica tramite l’analisi proteomica e l’utilizzo di una nuova linea cellulare ossea (IDG-SW3) in grado di andare incontro in vitro a completo differenziamento osteocitario partendo dallo stadio di pre-osteoblasta.

The purpose of this thesis is to analyze the structural bone tissue modifications and the alteration of osteocyte cell-signaling during the repair of experimentally induced bone lesions (in vivo) and in an immortalized cell model (in vitro) under the treatment of the osteo-protective drug Teriparatide. Teriparatide is the active fragment (1-34) of the endogenous human parathyroid hormone (PTH). The physiological effect of PTH is to induce hypercalcemia: this effect is partially achieved by increasing both the calcium intestinal absorption and the renal tubular reabsorption; however, under non-physiological conditions the hypercalcemia is mainly resulted by the increase of bone resorption. Many studies showed that chronic administration of high doses of PTH results in decreased bone mass while intermittent exposure to PTH activates osteoblast bone deposition. In particular, it has been shown that intermittent exposure to PTH increases bone density by stimulating osteogenesis; whereas continued exposure to the same hormone causes strong bone reabsorption. Most of the structural studies published so far about the effect of Teriparatide focused their attention on the amount of newly-deposed bone without investigating the quality of the newly-formed bone tissue; moreover most of the papers enhance the attention to the osteoblast’s cellular and molecular involvement during the process of bone repair, ignoring the pivotal role that the osteocytes play in the bone environment by means of the modulation of their signaling. In many previous published papers it has been shown that osteocytes are the main actors of the communication among bone cells, in particular they are in close contacts with osteoblasts through cytoplasmic extensions and specialized gap-junctions, indicative of their guide role. Bone regeneration retraces the sequence of events occurring in membranous ossification: after a preliminary formation of fibrous tissue and the successive vascular proliferation, two different types of osteogenesis follow: firstly the process of Static Osteogenesis (SO), which produces preliminary bony trabeculae with woven texture, under factors/cytokines of vascular origin, and after that the process of Dynamic Osteogenesis (DO) starts, in which osteoblasts, driven by osteocytes, produce a more ordered (mainly lamellar) and more mechanical valid bone. At the present state of knowledge there are no scientific references focused on the functional relationships among osteocytes and osteoblasts during the bone repair process. This doctoral work focused at first on the morphological analysis of qualitative repair of lesions experimentally induced in diaphysis of rats femurs and then on the study of the osteocyte cell-signaling, both in response to the treatment with Teriparatide in order to deepen the knowledge of morphological and molecular events that occur in bone regeneration, with particular attention to the osteocyte signaling. The results obtained showed that intermittent administration of Teriparatide in the animal model anticipates the beginning of Dynamic Osteogenesis, which is characterized by the production of a more resistant bone. The molecular biology data were performed on an osteocyte immortalized cellular model (MLO-Y4) treated with the drug at different time points. Microarray analysis showed different expression of genes involved in osteocyte signaling compared with the control condition. These results lead us to perform new and more focused analysis of proteomics and to use a new bone cell line (IDG-SW3). This cell line is capable of going through a complete differentiation from pre-osteoblast to late osteocyte, allowing us to better understand the signaling modifications that may occur during the treatment with Teriparatide.