Riassunto analitico
Prostate cancer is the most frequently occurring cancer in men and the third cause of cancer death in Europe. Identifying effective treatment for advanced-stage and castration-resistant PC remains a significant challenge. Given the complex pathophysiology of cancer, a multi-target approach could offer a promising strategy for developing more effective drugs.
The goal of my master thesis work, within Prof. Rastelli’s AIRC grant project, was to synthesize novel dual inhibitors targeting HDAC6 and HSP90, two key therapeutic enzymes involved in prostate cancer development and progression. Targeting both enzymes simultaneously offers several advantages over single-target inhibitors, as prostate cancer cells often activate compensatory survival pathways that limit the efficacy of monotherapies. HDAC6 plays a crucial role in cancer progression, regulating gene expression, promoting cancer cell proliferation and survival, facilitating cancer metastasis and favouring immune evasion. In addition, HDAC6 modulates the activity of Hsp90, a molecular chaperone that stabilize multiple oncogenic client proteins. Interestingly, HDAC6 is also a client protein of Hsp90, making these two enzymes closely interconnected. Thus, HDAC6/Hsp90 dual inhibitors could be effective in disrupting oncogenic signalling, enhancing cellular stress and promoting apoptosis, and reducing the likelihood of developing resistance, making them a valuable therapeutic strategy.
To achieve this goal, structural elements from both HDAC6 and HSP90 pharmacophores were integrated into a single molecular framework to optimize interactions with both enzyme active sites. The design focused on the incorporation of hydroxamate and isoxazole moiety as zinc binding groups, combined with modifications on the pyrrolopyrimidine and purine cores, aiming to balance HDAC6 selectivity, HSP90 binding affinity, and overall pharmacokinetic properties.
The in vitro results from our previous study showed that isoxazole-based inhibitors had demonstrated strong activity on HDAC6 but were not active on Hsp90, whereas hydroxamate-based derivatives exhibited dual HDAC6/HSP90 activity. To expand structure-activity relationships, specific modifications were applied to optimize target affinity, improve cellular activity and reduce cytotoxicity. In particular, in the isoxazole series, the fluorine atom on the phenyl linker was changed from 2- to 3-position to potentially improve HSP90 inhibitory activity while maintaining HDAC6 potency. In the hydroxamate series, the chlorine at position 4 of the pyrrolopyrimidine core was substituted with either a methoxy or a hydroxyl group to possibly modulate electronic properties, improve solubility, and introduce additional hydrogen-bonding group.
Among the 3-hydroxy isoxazole series (3-HIO) an eight steps synthetic route was explored and optimized, and three compounds were obtained and tested. The in vitro results show that BLP242 has a 4-fold improved inhibitory activity (sub-micromolar) on human recombinant HDAC6, however this is not reflected with an improved cellular activity, with a 3-fold higher GI50 in PC3 prostate cancer cells compared to its positional isomer. All the compounds were inactive on human recombinant Hsp90 protein.
Among the hydroxamate series, three compounds were successfully prepared using a five steps synthetic route. The compounds are under study and the results of the in silico design, chemical synthesis, and biological evaluation of the two series will be presented.
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Abstract
Il cancro alla prostata è il tumore più comune negli uomini e rappresenta la terza causa di morte per cancro in Europa. L'individuazione di un trattamento efficace per la malattia in stadio avanzato e resistente alla castrazione rimane una sfida significativa. Data la complessità della sua fisiopatologia, un approccio multi-target potrebbe offrire una strategia promettente per lo sviluppo di farmaci più efficaci.
Nell'ambito del progetto AIRC coordinato dal Prof. Rastelli, il mio lavoro di tesi si è focalizzato sulla sintesi di nuovi inibitori duali diretti contro HDAC6 e Hsp90, due enzimi terapeutici chiave coinvolti nella progressione del cancro alla prostata. L'inibizione simultanea di entrambi offre vantaggi rispetto agli approcci a bersaglio singolo, poiché le cellule tumorali spesso attivano percorsi di sopravvivenza compensatori che riducono l'efficacia delle monoterapie.
HDAC6 gioca un ruolo cruciale nella progressione del tumore, regolando l'espressione genica, favorendo la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule maligne, facilitando le metastasi e contribuendo all'evasione immunitaria. Inoltre, HDAC6 modula l'attività di Hsp90, una chaperone molecolare essenziale per la stabilizzazione di numerose proteine oncogeniche. È interessante notare che HDAC6 stesso è una proteina client di Hsp90, evidenziando un'interconnessione funzionale tra questi due enzimi.
Di conseguenza, gli inibitori duali di HDAC6 e Hsp90 potrebbero rappresentare una strategia terapeutica innovativa, in grado di interrompere la segnalazione oncogenica, amplificare lo stress cellulare, promuovere l'apoptosi e ridurre il rischio di resistenza ai trattamenti, migliorando così le prospettive terapeutiche per i pazienti con cancro alla prostata avanzato.
Per raggiungere questo obiettivo, gli elementi strutturali dei farmacofori di HDAC6 e Hsp90 sono stati integrati in un unico framework molecolare, ottimizzato per interagire con entrambi i siti attivi degli enzimi. Il design si è focalizzato sull'incorporazione dei gruppi idrossammato e isossazolo come gruppi chelanti dello zinco, in combinazione con modifiche sui nuclei pirrolopirimidinici e purinici, al fine di bilanciare la selettività per HDAC6, l'affinità di legame per Hsp90 e le proprietà farmacocinetiche complessive.
I risultati in vitro del nostro studio precedente hanno evidenziato che gli inibitori a base di isossazolo mostravano un'elevata attività su HDAC6, ma erano inefficaci contro Hsp90. Al contrario, i derivati contenenti idrossammato esibivano un'attività duale nei confronti di HDAC6 e Hsp90. Per ampliare la comprensione delle relazioni struttura-attività (SAR), sono state introdotte modifiche mirate volte a ottimizzare l'affinità per i bersagli, migliorare l'attività cellulare e ridurre la citotossicità.
Nella serie isossazolica, la posizione dell'atomo di fluoro sul linker fenilico è stata spostata dalla posizione 2 alla posizione 3, con l'obiettivo di potenziare l'attività inibitoria su Hsp90 mantenendo inalterata l'efficacia su HDAC6.
Nella serie idrossammatica, il sostituente cloro in posizione 4 del nucleo pirrolopirimidinico è stato sostituito con un gruppo metossilico o idrossilico, al fine di modulare le proprietà elettroniche, migliorare la solubilità e favorire la formazione di legame a idrogeno. Per la serie 3-idrossi-isossazolica (3-HIO) sono stati ottenuti tre nuovi composti. I dati in vitro hanno mostrato che BLP242 possiede un'attività inibitoria migliorata di quattro volte (sub-micromolare) nei confronti di HDAC6. Tuttavia, questo incremento non si è tradotto in un’efficacia cellulare superiore, poiché il valore di GI₅₀ nelle cellule di cancro alla prostata PC3 risulta tre volte superiore rispetto a quello del suo isomero posizionale. Per quanto riguarda la serie degli idrossammati, tre nuovi composti sono stati ottenuti attraverso una via sintetica in cinque step. Attualmente, i composti sono in fase di studio.
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